🔥 小鼠结肠固有层免疫细胞分离

流式细胞术应用广泛，是免疫表型及功能分析的常见实验方法。而获得高质量的单细胞悬液是流式实验成功的关键因素。

本为以小鼠结肠固有层免疫细胞分离为例，对单细胞悬液的获取方法进行简述。

• 剪刀、镊子、精细镊、黑色硅胶皿
• 无菌培养瓶、70 μm 的细胞过滤器、50 mL 的离心管
• 预消化液：5 mL的FBS（5%），1 mL 的 5 M EDTA（invitrogen，AM9260G）（5 mM），稀释于预先配制好的 HBSS 中，定容至 100 mL，充分混匀，现用现配
• 酶消化液：15 g collagenase D，4 mg DNase Ⅰ，0.3 g dispaseⅡ 溶解于 100 mL 预热的 HBSS/5% FBS 的溶液中，现用现配

（1）小鼠处死后迅速取出结肠，去除肠系膜，将结肠放置于含有冰冷PBS液的无菌培养皿中，沿肠系膜纵向剪开结肠，在PBS中剧烈摇晃，清洗结肠，去除肠腔内容物；

（2）将结肠固定在黑色硅胶皿上，精细镊在体视显微镜下迅速分离黏膜层；

（3）无菌剪刀将结肠黏膜组织剪成约 1 mm 的碎片，将剪碎的黏膜组织转移置于预热的装有不含钙镁的 HBSS（5% FBS和5 mM EDTA）溶液的无菌培养瓶中，37 ℃，250 rpm，震荡 20 min，弃掉液体，重复两次；

（4）第二次震荡后，过滤，用滤纸吸去多余的液体（保证去除残留的EDTA），将结肠转移至 1.5 mL 的 EP 管中剪碎；

（5）将黏膜组织碎片转移至含 20 mL 结肠固有层消化液（1.5 g/L collagenase D，40 mg/L DNase Ⅰ，3 g/L dispaseⅡ 溶解于不含钙镁的 HBSS 溶液）的无菌培养瓶中，37 ℃，250 rpm，消化 10-20 min；

（6）充分涡旋，70 μm 的细胞过滤器过滤，收集上清液至 50 mL 的离心管中，4 ℃，1500 rpm，离心 10 min；

（7）弃上清，将分离的细胞沉淀重新悬浮在冰不含钙镁的 HBSS/FBS 缓冲液中，样本置于冰上，染色；

（8）用细胞染色液（cell staining buffer；BD Pharmingen TM）清洗细胞，4 ℃，2000 rpm，离心 5 min；

（9）根据细胞量加入适当体积的封闭抗体和荧光抗体，上机检测。

• 实验前所有器械消毒，高压灭菌，液体无菌过滤；
• 实验中注意充分消化以保证检测细胞量足够；
• 多色流式需要注意某些 CD 分子位于跨膜区，细胞仍需要固定破膜处理，如 CD68,CD206；
• 用于分选或后续培养需保证全称无菌操作。