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🔥 小鼠结肠固有层免疫细胞分离

相关实验:🔥 原代细胞培养实验

别名:Isolation of immune cells from lamina propria of mouse colon

最新修订时间:

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合作专家 | 孙齐博士

生理学 首都医科大学

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审核专家 | 李娜硕士

生理学 大连医科大学

原理

流式细胞术应用广泛,是免疫表型及功能分析的常见实验方法。而获得高质量的单细胞悬液是流式实验成功的关键因素。

本为以小鼠结肠固有层免疫细胞分离为例,对单细胞悬液的获取方法进行简述。

材料与仪器

  • 剪刀、镊子、精细镊、黑色硅胶皿
  • 无菌培养瓶、70 μm 的细胞过滤器、50 mL 的离心管
  • 预消化液:5 mL的FBS(5%),1 mL 的 5 M EDTA(invitrogen,AM9260G)(5 mM),稀释于预先配制好的 HBSS 中,定容至 100 mL,充分混匀,现用现配
  • 酶消化液:15 g collagenase D,4 mg DNase Ⅰ,0.3 g dispaseⅡ 溶解于 100 mL 预热的 HBSS/5% FBS 的溶液中,现用现配

步骤

(1)小鼠处死后迅速取出结肠,去除肠系膜,将结肠放置于含有冰冷PBS液的无菌培养皿中,沿肠系膜纵向剪开结肠,在PBS中剧烈摇晃,清洗结肠,去除肠腔内容物;

(2)将结肠固定在黑色硅胶皿上,精细镊在体视显微镜下迅速分离黏膜层;

(3)无菌剪刀将结肠黏膜组织剪成约 1 mm 的碎片,将剪碎的黏膜组织转移置于预热的装有不含钙镁的 HBSS(5% FBS和5 mM EDTA)溶液的无菌培养瓶中,37 ℃,250 rpm,震荡 20 min,弃掉液体,重复两次;

(4)第二次震荡后,过滤,用滤纸吸去多余的液体(保证去除残留的EDTA),将结肠转移至 1.5 mL 的 EP 管中剪碎;

(5)将黏膜组织碎片转移至含 20 mL 结肠固有层消化液(1.5 g/L collagenase D,40 mg/L DNase Ⅰ,3 g/L dispaseⅡ 溶解于不含钙镁的 HBSS 溶液)的无菌培养瓶中,37 ℃,250 rpm,消化 10-20 min;

(6)充分涡旋,70 μm 的细胞过滤器过滤,收集上清液至 50 mL 的离心管中,4 ℃,1500 rpm,离心 10 min;

(7)弃上清,将分离的细胞沉淀重新悬浮在冰不含钙镁的 HBSS/FBS 缓冲液中,样本置于冰上,染色;

(8)用细胞染色液(cell staining buffer;BD Pharmingen TM)清洗细胞,4 ℃,2000 rpm,离心 5 min;

(9)根据细胞量加入适当体积的封闭抗体和荧光抗体,上机检测。

注意事项

  • 实验前所有器械消毒,高压灭菌,液体无菌过滤;
  • 实验中注意充分消化以保证检测细胞量足够;
  • 多色流式需要注意某些 CD 分子位于跨膜区,细胞仍需要固定破膜处理,如 CD68,CD206;
  • 用于分选或后续培养需保证全称无菌操作。

来源:丁香实验

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