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🔥 小鼠原代肠胶质细胞分离培养

相关实验:🔥 原代细胞培养实验

别名:Isolation and culture of mouse primary enteric glial cell,EGC

最新修订时间:

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合作专家 | 孙齐博士

生理学 首都医科大学

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审核专家 | 李娜硕士

生理学 大连医科大学

原理

参考无血清培养法去除雪旺细胞培养中成纤维细胞污染的方法,结合目前已有的肠肌间神经丛神经胶质细胞原代分离、培养法的报道,我们对小鼠结肠胶质细胞进行分离培养,获得了纯度较高且活性良好的结肠肌间神经丛肠胶质细胞。

材料与仪器

  • 无菌Hanks 平衡盐溶液( Hank’s balanced salt solution,HBSS)、无菌 PBS 溶液、05% 胰蛋白酶、DMEM/F12 培养基、及青霉素/链霉素(Penicillin/Streptomycin, PS)、胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)、多聚赖氨酸( Poly-L-lysine solution,PLL)
  • 玻璃棒、精细镊、70 μm 细胞过滤器、24 孔板
  • 消化液:BSA(3 mg/mL)和II型胶原酶(1.3 mg/mL)溶于 10mL K-HS 溶液

步骤

(1)新鲜分离的小鼠结肠组织置于无菌冰冷的 HBSS 溶液中清洗;

(2)将 3~5 cm 结肠肠管套在玻璃棒上,精细镊小心剥离肠神经丛,置于无菌冰冷的 HBSS 溶液中;

(3)4 ℃,356g,离心 30s,重复三次清洗组织;

(4)将组织剪碎,置于加入BSA(0.3 mg/mL)和II型胶原酶(1.3 mg/mL)的预热 K-HS 溶液,37℃,消化 60 min;

(5)4℃,356 g,离心 8 min,弃上清;

(6)EP 管中加入 5 mL 0.05% 的胰蛋白酶,37 ℃ 消化 7 min,随后以等量的培养基(DMEM/F12 培养基,10%FBS,1%PS)终止消化;

(7)离心弃上清,重悬,充分吹打混匀,70 μm 的细胞过滤器过滤;

(8)离心弃上清,重悬,充分吹打混匀,并接种到多聚赖氨酸包被的24孔板中,将孔板至于 37℃,5% CO2 细胞孵箱内培养;

(9)2d 后于显微镜下可观察到 EGC 已贴壁,但上清中可见呈现杆状且悬浮的肌细胞以及组织碎片,用无菌的 PBS 清洗 3 次以去除未贴壁细胞,更换为新鲜的培养基继续培养;若见少量肌细胞贴壁,可采用 0.05% 胰蛋白酶消化 3min 去除肌细胞,继而用无菌 PBS 清洗 3 次,再更换为新鲜的培养基继续培养。

(9)每两天换液,每周交替使用含血清和无血清培养基去除残余的成纤维细胞,以获得更高纯度的肠胶质细胞,用于随后的免疫组织化学染色和传代培养。

注意事项

  • 实验前所有器械消毒,高压灭菌,液体无菌过滤;
  • 酶消化液现用现配;
  • 实验中注意充分消化以保证检测细胞量足够;
  • 用于后续培养需保证全称无菌操作;
  • 每两天换液一次,交替使用含血清和无血清培养基,及时观察细胞形态。

来源:丁香实验

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