🔥 小鼠原代肠胶质细胞分离培养

参考无血清培养法去除雪旺细胞培养中成纤维细胞污染的方法，结合目前已有的肠肌间神经丛神经胶质细胞原代分离、培养法的报道，我们对小鼠结肠胶质细胞进行分离培养，获得了纯度较高且活性良好的结肠肌间神经丛肠胶质细胞。

• 无菌Hanks 平衡盐溶液( Hank’s balanced salt solution，HBSS)、无菌 PBS 溶液、05% 胰蛋白酶、DMEM/F12 培养基、及青霉素/链霉素（Penicillin/Streptomycin, PS）、胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）、多聚赖氨酸( Poly-L-lysine solution，PLL)
• 玻璃棒、精细镊、70 μm 细胞过滤器、24 孔板
• 消化液：BSA（3 mg/mL）和II型胶原酶（1.3 mg/mL）溶于 10mL K-HS 溶液

（1）新鲜分离的小鼠结肠组织置于无菌冰冷的 HBSS 溶液中清洗；

（2）将 3～5 cm 结肠肠管套在玻璃棒上，精细镊小心剥离肠神经丛，置于无菌冰冷的 HBSS 溶液中；

（3）4 ℃，356g，离心 30s，重复三次清洗组织；

（4）将组织剪碎，置于加入BSA（0.3 mg/mL）和II型胶原酶（1.3 mg/mL）的预热 K-HS 溶液，37℃，消化 60 min；

（5）4℃，356 g，离心 8 min，弃上清；

（6）EP 管中加入 5 mL 0.05% 的胰蛋白酶，37 ℃ 消化 7 min，随后以等量的培养基（DMEM/F12 培养基，10%FBS，1%PS）终止消化；

（7）离心弃上清，重悬，充分吹打混匀，70 μm 的细胞过滤器过滤；

（8）离心弃上清，重悬，充分吹打混匀，并接种到多聚赖氨酸包被的24孔板中，将孔板至于 37℃，5% CO2 细胞孵箱内培养；

（9）2d 后于显微镜下可观察到 EGC 已贴壁，但上清中可见呈现杆状且悬浮的肌细胞以及组织碎片，用无菌的 PBS 清洗 3 次以去除未贴壁细胞，更换为新鲜的培养基继续培养；若见少量肌细胞贴壁，可采用 0.05% 胰蛋白酶消化 3min 去除肌细胞，继而用无菌 PBS 清洗 3 次，再更换为新鲜的培养基继续培养。

（9）每两天换液，每周交替使用含血清和无血清培养基去除残余的成纤维细胞，以获得更高纯度的肠胶质细胞，用于随后的免疫组织化学染色和传代培养。

• 实验前所有器械消毒，高压灭菌，液体无菌过滤；
• 酶消化液现用现配；
• 实验中注意充分消化以保证检测细胞量足够；
• 用于后续培养需保证全称无菌操作；
• 每两天换液一次，交替使用含血清和无血清培养基，及时观察细胞形态。