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亲和层析纯化MHC II类分子测定多肽亲和力

相关实验:Th细胞表位的鉴定

最新修订时间:

材料与仪器

器材:

抗体-Sepharose CL-4B 亲和层析柱、蛋白 A-Sepharose 柱

试剂:

① 抗 MHC II 类分子单克隆抗体

② 10 mmol/L Tris-HCI PBS(pH8.0,含 1% NP-40)

③ 含 0.4% n-octylglucoside 的 PBS

④ 含 50 mmol/L 二乙胺、0.4% n-octylglucoside 的 0.15 mol/L NaCl(pH11.5)

⑤ 2.0 mol/L Tris(pH6.8)

步骤

亲和层析纯化 MHC II 类分子测定多肽亲和力方法的基本流程如下:

(1)将抗 MHC II 类分子单克隆抗体连接到琼脂糖凝胶 CL-4B(Sepharose CL-4B)上,装柱,制成抗体-Sepharose CL-4B 亲和层析柱。

(2)裂解后的细胞溶液过未活化的 SepharoseCL4-B 柱和蛋白 A-Sepharose 柱 2 次后,过抗体-Sepharose CL-4B 亲和层析柱。用 10 个柱体积的 10 mmol/L Tris-HCI PBS(pH8.0,含 1% NP-40)、2 个柱体积的 PBS 和 2 个柱体积的含 0.4% n-octylglucoside 的 PBS 洗柱。

(3)用含 50 mmol/L 二乙胺、0.4% n-octylglucoside 的 0.15 mol/L NaCl(pH11.5)将 MHC II 类分子从柱上洗脱下来。收集洗脱液,加入 1/25 体积的 2.0 mol/LTris(pH6.8),使洗脱液的 pH 降至 8.0。

(4)浓缩洗脱液。

来源:丁香实验

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