基因工程抗体活性及亲和力的测定
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基因工程抗体活性及亲和力的测定
基因工程抗体活性的测定方法主要采用免疫学的常规手段，如免疫荧光技术，免疫酶技术，放射免疫分析技术(RIA)等。表达的抗体片段如Fv、ScFv、VH等缺少完整抗体的恒定区即Fc段，常规ELISA方法中酶标二抗无法与之直接反应，制备可变区的抗体方法又非常复杂和困难。
因此，主要采用免疫竞争抑制法，即通过抗体如ScFv与相应McAb对抗原结合的竞争抑制，间接测定抗体的活性，但需要所表达抗体具有高亲和力。
另外，可以表达抗体的融合蛋白，如噬菌体抗体的表达，抗体片段如ScFv与M13噬菌体基因Ⅲ产物gp3融合，通过M13 McAb来测定ScFv抗体的活性。
亲和力（affinity)是指抗体结合部位(可变区)与抗原决定簇的结合强度，是对结合强度的动力学量度。亲和力的表达方式：
Ab(抗体)＋Ag(抗原)＝AbAg(抗原抗体复合物)
Ka为结合常数；Kd为解离常数；按照质量作用定律，复合物形成速率与反应物的浓度成比例，平衡时，结合与解离的速率相等。
Ka(Ab)(Ag)=Kd(AbAg)
K=Ka/Kd=Kd(AbAg)
K=Ka/Kd=(AbAg)/(Ab)(Ag)
Ka为平衡常数，即抗体结合部位的亲和力。单位为mol-1 。
抗体亲合力的测定涉及抗体结合部位和抗原决定簇，因此要求抗体和抗原为液体的纯品。目前测定抗体亲和力的方法比较多，如平衡透析法、竞争结合法、荧光增强法、硫氰酸盐洗脱法、酶联免疫测定法(ELISA)和固相放射免疫测定法(SPRIA)等。
其中ELISA法和SPRIA法是最敏感的检测方法，但其是否依赖抗体的亲和力尚存在争论.通常采用竞争结合及Scatchard作图法。McAb的亲和力通常为1×105 ～1×1012 mol-1 。
根据质量作用定律，在理想结合反应中：
(B)=Ka(F)(T-B)
(B)：结合的抗体浓度；(F)：游离抗原浓度；(T)：总抗体浓度；Ka结合常数。若仅有部分(r部分)抗体参与反应，则有：
(B)=Ka(F)(rT-B)
则：(T)/(B)=1/r+1/rKa(F) (1)
如抗原无限过剩即(F)无限大，则(T)/(B)=1/r。对抗原系列稀释，以T/B为纵座标，1/(F)为横座标作图，当中1/(F)=0时，横座标截距即为r值。可以反应出抗体活性，即10n
细胞(抗原)结合抗体的最大结合容量(nmol)。利用公式(1)进行Scatchad分析作图，以结合(Ab)/游离(Ab)为纵座标，结合(Ab)为横座标绘制Scatchard图，K为纵座标截距/横座标截距，单位mol-1 。
【材料和试剂】
（1） 同位素125 I。
（2） 抗原为肿瘤细胞。
（3） 抗肿瘤细胞表面抗原的抗体。
（4） γ计数仪。
（5） Sephadex G-75
（6） 含1％BSA的PBS等。
【操作步骤】
（1）用125 I标记抗体。通过Sephadex G-75分子筛分离标志抗体，将125 I-抗体溶于含1％BSA的PBS中，γ计数仪测定计数，即(T)值；
（2）准备5×106 细胞，用含1％BSA的PBS将细胞进行系列倍比稀释，各管加125 I－抗体(终浓度13ng/ml)，37℃温育2h。用PBS洗各管细胞3min，8000r/min离心15s，弃上清，反复3～5次。用γ计数仪对各管测定，即(B)值。绘图，利用横座标为0，计算出r值，即细胞(抗原)的最大结合容量，也就是每个细胞和结合抗体的分子数(nmol)。
（3）对125 I-抗体(30μg/ml)进行系列倍比稀释，各管加1～2×106 细胞，37℃温育2h，用PBS洗3～5次，用γ计数仪测定。绘制Scatchard图，计算亲和常数(Ka)。
