简介
间接 ELISA 法较前述竞争性 ELISA 有所改进，可直接采用杂交瘤细胞培养上清进行测定，无需纯化抗体，无需对抗原精确定量，无需计算 K 值，特别适宜于针对同一抗原的多株不同 McAb 之间亲和力差别的比较。
原理
间接 ELISA 法测定 McAb 相对亲和力的基本原理是是 McAb 亲和力的鉴定实验的基本原理是抗体亲和力指抗体与抗原或半抗原结合的牢固程度，其高低是由抗原分子的大小、抗体分子的结合位点与抗原决定簇（表位）之间立体构象的合适程度决定的。
材料与仪器
器材：ELISA 板、离心管、恒温培养箱、酶标仪等。
试剂：
① 待检 McAb。
② 纯化的特异性抗原。
③ HRP 标记的兔（或羊）抗鼠 IgG 抗体。
④ 封闭液、稀释液和洗涤液：含 0.5％-1％ BSA 的 PBS 作为封闭液，含 0.1％BSA 的 PBS 作为稀释液，含 0.05％-0.1％Tween20 的 PBS 作为洗涤液，pH7.2。
步骤
间接 ELISA 法测定 McAb 相对亲和力的基本过程可分为如下几步：
A 取合适浓度的纯化抗原包被 ELISA 板，100μl/孔，4℃ 过夜。
B 洗涤后，37℃ 封闭 ELISA 板 30-60 分钟。
C 加入系列稀释的已知浓度的被检杂交瘤细胞培养上清液，100μl/孔，37℃ 孵育 1 小时。
D 洗涤后，加入适宜稀释度的 HRP 标记兔（或羊）抗鼠 IgG 抗体，100μl/孔，37℃ 孵育 1 小时。
E 洗涤后，加入 TMB 底物液，100μl/孔，37℃ 避光显色 20 分钟。
F 2mol/L H，SO4 终止反应后，测定各孔 450nm 的 A 值。以被检 McAb 的不同浓度为横坐标，对应 A450nm 值为纵坐标，绘制曲线，将曲线上部趋于平坦段的 A 值设为 100％，查出 A 值为 50％ 点的 McAb 浓度，借此表示该 McAb 的相对亲和力，可与识别相同抗原的其他 McAb 的相对亲和力进行比较。所需 McAb 浓度越低，表明其亲和力越高。
注意事项
1 本法所用抗原必须是纯化抗原。
2 抗原包被浓度和酶标抗体浓度均需事先滴定，选择出合适的工作浓度。
3 被检 McAb 的起始浓度一定要足够大，否则得不到测定曲线的平坦段，因而也就无法获得正确的 50％ 结合点
来源：丁香实验
