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竞争 ELISA 法测定 McAb 亲和常数

相关实验:McAb 亲和力的鉴定实验

最新修订时间:

简介

竞争 ELISA 法是一种简便易行的亲和力测定方法。

原理

竞争 ELISA 法测定 McAb 亲和常数的基本原理是 McAb 亲和力的鉴定实验的基本原理是抗体亲和力指抗体与抗原或半抗原结合的牢固程度,其高低是由抗原分子的大小、抗体分子的结合位点与抗原决定簇(表位)之间立体构象的合适程度决定的。

材料与仪器

【器材】

ELISA 板、离心管、恒温培养箱、酶标仪等。

【试剂】

①待检 McAb
②纯化的特异性抗原
③HRP 标记的兔(或羊)抗鼠 IgG 抗体
④封闭液、稀释液和洗涤液:含 0.5%-1% BSA 的 PBS 作为封闭液,含 0.1% BSA 的 PBS 作为稀释液,含 0.05%-0.1% Tween 20 的 PBS 作为洗涤液,pH7.2

 

步骤

竞争 ELISA 法测定 McAb 亲和常数的基本过程如下:

1、取适宜浓度的纯化抗原包被 ELISA 板,100μl/孔,4℃ 过夜。
 
2、洗涤后,加入封闭液,200μl/孔,37℃ 孵育 30-60 分钟。
 
3、取一定浓度的 McAb,与系列倍比稀释的抗原混合,4℃ 过夜,使反应达到平衡。
 
4、将平衡后的抗原-抗体复合物加入到上述已用抗原包被并封闭过的 ELISA 板中,100μl/孔,37℃ 孵育 1 小时。
 
5、洗涤后,加入工作浓度的 HRP 标记兔(或羊)抗鼠 IgG 抗体,100μl/孔,37℃ 孵育 1 小时。
 
6、洗涤后,加入底物(TMB)溶液,100μl/孔,37℃ 避光显色 20 分钟。
 
7、2mol/L H2SO4 终止反应后,于 450nm 波长处测定各孔的光吸收值(OD 值或 A 值)。

8、按下列公式计算 McAb 的亲和常数(K),其中,A0=无抗原时 A 值;A=采用不同浓度抗原时的 A 值;a0=抗原总量;K=亲和常数。


注意事项

1、本法所用抗原必须是纯化抗原,而且抗原需求量较大。
 
2、抗原包被浓度、被检 McAb 浓度以及酶标抗体浓度均需经过事先确定,选择出合适的工作浓度。
 
3、在抗原抗体混合作用时,所用抗原浓度至少要比抗体浓度高 10 倍以上。

 

来源:丁香实验

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