丁香实验_LOGO
登录
提问
提问
我要登录
|免费注册
丁香通
点赞
收藏
wx-share
分享

检测人IFNγ的PVDF Elispot法

互联网

931
相关专题
酶联免疫斑点法(ELISpot)

试剂盒内容:PVDF96孔板,室温保存;0.1ml捕获抗体,4℃保存;0.1ml生物素标记检测抗体,4℃保存;15ul亲和素碱性磷酸酶标,4℃保存;0.25g牛血清白蛋白,4℃保存;0.25g脱脂乳,4℃保存;11ml底物缓冲液,4℃保存;11ml浓缩PBS (10X),室温保存;11ml浓缩洗涤液(200x),室温保存

自备材料/试剂: 细胞培养 液,CO2孵育箱,70%酒精

直接的和间接的Eli-spot法

可在已包被抗体的孔中直接刺激细胞(直接法),或在24孔板或烧瓶中先刺激细胞,然后放入已包被的孔中(间接法)。使用哪种方法基于:1)检测细胞的类型;2)希望得到的细胞量。如果只需少量的细胞因子 生成细胞,使用直接法;如果细胞因子生成细胞较多,最好使用间接法。其它步骤一致。

刺激方法:建议用PMA和娄诺霉素刺激PBMC,使其产生IFNγ。

在培养液中稀释PBMC(如:RPMI 1640加2mM谷氨酸盐和10%加热失活的小牛血清),其中含1ng/ml PMA和500ng/ml娄诺霉素(Sigma, Saint Louis, MO)。加2.104至5.104个细胞到抗体包被的PVDF孔,孵育箱中孵育10-15小时。其它的刺激剂孵育时间可能不同,基于细胞因子 生成细胞的量,按不同情况作最佳选择。

试剂的准备:1. 10ml磷酸缓冲盐(PBS ,10X)以90ml蒸馏水稀释;2. 0.22g脱脂乳用11ml稀释的PBS溶解,最终浓度为2%;3. 0.22gBSA溶解于22ml已稀释的PBS,最终浓度为1%;4. 10ml浓缩洗涤液(200x)以1990ml蒸馏水稀释;5. 10ul亲和素碱性磷酸酶以10ml PBS-1%,BSA稀释6. 7ml酒精以3ml蒸馏水稀释,最终浓度为70%。

Eli-spot操作过程:

1. 用100ul 70%酒精孵育PVDF孔板,室温下孵育10分钟。

2. 倒去酒精,用100ul PBS洗涤3次。

3. 3.将100ul捕获抗体加入10ml PBS中,混合,每孔加100ul, 盖上板盖,4℃过夜。

4.倒去液体,100ul PBS洗涤一次。

5.每孔加入100ul 2%脱脂乳PBS(见试剂准备),盖上板盖,室温下孵育2小时。

6.在水槽边和吸水纸上轻打,倒去液体。

7.用100ul PBS洗涤一次。

8.每孔加入100ul细胞悬浮液(含适当量的细胞和相应浓度的刺激剂)。细胞可预先在体外接受刺激(间接Eli-spot)。盖上标准的96孔板塑料板盖,37℃ CO2孵育箱中孵育一定的时间(15-20小时)。这期间不要晃动或移动孔板。

9.在水槽边和吸水纸上轻打,倒去液体。

10.每孔加100ul洗涤缓冲液,4℃孵育10分钟。

11.用100ul洗涤缓冲液洗孔3次。

12.于10ml PBS-1%BSA中稀释100ul检测抗体,此为一板的量。每孔加100ul此液体,盖上板盖,37℃下孵育1小时30分。

13.倒去液体,用100ul洗涤缓冲液洗3次。

14.每板以10ml PBS-1%BSA稀释10ul的亲和素碱性磷酸酶。每孔加入100ul此液体,盖上板盖,37℃孵育1小时。

15.倒去液体,用100ul洗涤缓冲液洗3次。在吸水纸上拍打,吸干残留的洗涤液。

16.每孔加入100ul BCIP/NBT。

17.室温下反应5-15分钟。完全显色后,将此液倒于相应的盘中。

18.用蒸馏水充分洗涤膜的两边。吸水纸上轻拍,使膜干燥。保存时,将板倒置以免残留的液体流回膜上一旦膜干燥后,读取点数。4℃下放置一夜,点会比较明显。

此板在室温下避光保存。

使用时应注意BCIP/NBT缓冲液是潜在的至癌物质,试验时带手套,使用后适当处理。对MAIPAN4510板,孵育时由于毛细作用,试剂渗入膜中,此液体难以洗去,因此导致背景增加。为了避免此情况,建议在步骤12时将板底移去,将膜倒转,用蒸馏水流冲洗,同时用洗涤缓冲液按正常的步骤洗涤。在步骤14中,由于板底已移去,建议将MAIP4510板放于空的96孔板上,其后的步骤不变。

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
关注公众号
反馈
TOP
打开小程序