材料与仪器
血液样品 细胞样品
70％乙醇 PBS 脱脂奶粉 链霉亲和素 检测抗体 包被抗体
PVDF膜 96孔培养板 硝基纤维素底板 免疫斑点板 酶标板
70％乙醇 PBS 脱脂奶粉 链霉亲和素 检测抗体 包被抗体
PVDF膜 96孔培养板 硝基纤维素底板 免疫斑点板 酶标板
步骤
一、包被96孔板
用70％乙醇浸润96孔板中的PVDF膜30 s
加入捕获抗体（PBS稀释），4℃过夜
倒空板中包被液，轻轻在纸上拍干，用PBS洗涤，禁用洗板机
加入100ul 2%的脱脂奶粉（或者BSA）室温孵育2小时，封闭板中空白位点
PBS洗涤1次。（如果暂时不用，可将96孔板干燥后4保存，可保存2周以上）
二、细胞刺激和细胞因子捕获
从新鲜血液中用Ficoll分离PBMC并进行计后，将细胞用培养液稀释后加入96孔板中。细胞数量需要优化，最好进行备比稀释以确定合适的细胞数量。通常所用细胞数量为1-2×105/孔。
将96孔板在37℃ CO2孵箱中孵育过夜。禁止移动或晃动板子。
用含0.1% Tween 20 的PBS孵育10分钟，去除细胞和未结合的细胞因子。然后用含0.1% Tween 20 的PBS洗涤3次。 禁用洗板机。
三、加入检测抗体检测
加入标记的检测抗体（用含1％BSA的PBS稀释），室温孵育1-2小时。
加入底物显色（如果检测抗体为酶标）或者荧光直接检测（如果检测抗体是荧光标记）：在加入底物之前用蒸馏水洗涤板子膜的两侧，以防止部分溶液漏出后导致的背景。监测斑点的形成，适时终止反应。
用蒸馏水洗涤终止反应。
四、结果分析
将96孔板干燥。（将板子放在4℃避光过夜，可使斑点边缘锐化，更易分辨）
使用读板仪进行结果分析
ELISpot实验需要的试剂：
PVDF包被的96孔板 包被抗体 标记的检测抗体（酶、Biotin、荧光） AP/HRP－链霉亲和素（如果检测抗体是Biotin标记） 底物溶液 各种缓冲液：包被液、稀释液、洗涤液等 阳性对照：重组的细胞因子或者已知产生细胞因子的细胞 96孔板- 硝基纤维素底板、
常见问题
一、PVDF-底的免疫斑点板或者平底的酶标板 ELISpot技术要点
1. 操作BCIP/NBT显色液时最好戴上手套。
2. 为了防止边缘影响，最好在96孔扳外面包裹锡箔膜，包裹直到显色结束再弃去。
3. 加样细胞和试剂时加样枪头千万不能碰触孔底的PVDF膜，以防止损坏PVDF膜。
4. 常用的96孔扳虽然不是无菌的，但是短暂的孵育时间和培养液中抗生素的存在，ELISpot的操作过程不会有污染的麻烦。
5. 绝大部分板子只能一次做完，请务必在实验开始之前设计好实验方案，尽量最大程度地利用板孔和试剂。
6. 检测抗体和酶最好现配现用。
7. 为保证结果的准确性，建议作双复孔或三复孔。
8. 实验结束后，不要在高于37℃的温度下干燥，否则PVDF膜可能会破裂。
9. 推荐以下对照设定：
（1）阳性对照：重组细胞因子或确定能分泌该种细胞因子的细胞 阴性对照：相同数量的未刺激细胞 背景对照：无菌细胞培养液 检测抗体对照：用PBS代替检测抗体
二、ELISpot技术介绍
二、ELISpot技术介绍
从单细胞水平观察分泌蛋白的表达已成为目前研究细胞功能的重要内容，酶联免疫斑点法(ELISpot)技术巧妙地运用了酶联免疫吸附技术，从方法上解决了该难题，已广泛运用于各项重要课题研究中。ELISpot最初用于检测分泌抗原特异性抗体的个体B细胞，以后该方法不断改进，用于检测分泌特定抗原的单个细胞。
相比较于流式细胞仪、免疫组化、原位杂交等其它在单细胞水平检测蛋白分泌能力的方法，ELISpot方法更为简单和稳定，同时具有更高的灵敏度。 ELISpot方法操作简便，但却能提供非常类似于体内实验的环境。在单细胞水平进行特定抗原的监控，可以模拟体内环境，跟踪细胞因子的产生，是检测细胞功能的独特手段。现已被广泛运用于世界各大实验室的疾病诊断和科学研究活动之中。
自1983年以来，ELISpot方法得到越来越广泛的应用，主要包括以下几个方面：
B细胞杂交瘤的筛选、 化合物和药物免疫学反应的筛选、 优化树突细胞和T细胞的抗肿瘤活性、 靶向疫苗的质控、 自身免疫疾病的诊断和预后分析、 自身免疫疾病的免疫治疗的监控、 过敏性疾病的脱敏治疗的监测、 器官移植中排斥反应的预测 、干细胞功能分析、 基因治疗中转染效率的检测、组织、肿瘤和免疫细胞低频分泌谱的分析等等。
来源：丁香实验
