【trouble shooting】酶联免疫斑点（ELISPOT）FAQ

一、关于ELISPOT

1、什么是ELISPOT检测?

酶联免疫斑点（ enzyme-linked immunosorbent spot， ELISPOT） 检测技术是通过两种高亲和力的特异性抗细胞因子抗体来检测淋巴细胞分泌细胞因子情况的一种方法。

淋巴细胞在体内被抗原激活后，或者在体外培养中被培养液中含有的特异性抗原或刺激剂激活后，将这些细胞转入ELISPOT培养板中。这些活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子，在孵育的过程中可在分泌细胞原位被ELISPOT培养板上包被的特异性细胞因子抗体所捕获。

将细胞和过量的细胞因子洗除后，加入生物素标记的检测抗体，孵育后洗去多余检测抗体。

然后加入酶标记的链亲和素（二抗），孵育后洗去多余酶标链亲和素（二抗）。最后加入酶的底物，作用后可形成不溶的颜色产物即斑点（SPOT）。

每个斑点是激活的淋巴细胞分泌的细胞因子区域，代表一个活性淋巴细胞。实验结果可在显微镜下观察或使用酶联免疫斑点自动图象分析仪（BioReader 4000 Pro-X）来进行计数分析。该方法可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗原的反应能力及记数特异性抗原刺激下分泌性淋巴细胞产生的情况。

2、ELISPOT检测比ELISA优越性在哪里？

ELISPOT比ELISA灵敏度高102～103倍。ELISPOT不仅能分析细胞因子分泌的总量变化，更能独特检测活化淋巴细胞的数量变化。ELISPOT可精确到检测出一百万个淋巴细胞中的一个活化细胞的细胞因子分泌。

3、ELISPOT适用于哪些细胞的检测？

理论上讲，所有能分泌细胞因子的细胞都可以用ELISPOT进行检测分析。实际应用中常见的检测细胞类型包括：外周血淋巴细胞（PBMC）、骨髓、或者中枢神经系统和淋巴组织的单细胞悬液。

4、我现在的进行的试验是疫苗研究（或者任何别的免疫学研究），我能用ELISPOT来帮助我的试验进程吗？

ELISPOT是一个崭新的技术平台，它适用于多种免疫学研究的精确分析。对于疫苗研究，中国药品生物制品检定所在《预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则》及《预防用以病毒为载体的活疫苗制剂的技术指标原则》等规定中均指出，ELISPOT是检测和评价疫苗的细胞免疫的有效方法。

二、关于ELISPOT试验技术中对细胞的处理

1、提取外周血淋巴细胞时，有那些注意事项？

如果取外周血淋巴细胞（PBMC） 进行ELISPOT检测，最好采用新鲜血液。在保证无菌操作的前提下，首先应保证取血时抗凝剂应及时充分的与血液混匀，避免血凝块的出现。抗凝血最好及时提取PBMC，避免放置时间过长，室温下避免过夜。应选用分离效果好的淋巴细胞分离液，避免PBMC中混有过多其他细胞成分或杂质。

2、在分离外周血淋巴细胞时，发生了溶血，会影响我的试验结果吗？

外周血出现溶血后，在使用淋巴细胞分离液分离PBMC时，溶血产生的细胞碎片、血红素等杂质将极大可能悬浮于分离液的层面，在吸取PBMC时非常容易混入这些杂质，由于混入细胞的细胞碎片和血红素很难清洗去除，在进行ELISPOT实验时，有可能沉积在培养板底，严重影响细胞因子和抗体的结合，进而影响实验结果。

3、采用什么方法分离外周血淋巴细胞适合于ELISPOT试验？

使用淋巴细胞分离液，推荐使用进口淋巴细胞分离液，如：Lymphoprep，或者NycoPrep 1.077（无寡糖）。避免使用红细胞裂解液分离淋巴细胞。

4、从动物脾脏组织分离淋巴细胞应如何操作？

取动物脾脏组织时，应注意取材的无菌操作。分离出脾脏组织，研磨后过200目筛网，保证所分离的细胞为单个细胞悬液。获得细胞悬液后应该使用相应的淋巴细胞分离液进一步分离单个核细胞。

5、在ELISPOT板上，每孔我应该放置多少数目的淋巴细胞？

在使用ConA，PHA等阳性刺激孔中，一般放置的淋巴细胞数为104～2×105.在使用抗原作为刺激剂的情况下，每孔细胞浓度可在1～4×105.在使用多克隆刺激剂的情况下，应适当调低细胞浓度。但由于所用刺激剂的强度和批号不同，建议初次进行ELISPOT检测时，对刺激剂浓度和细胞浓度设立梯度，以保证较理想的实验结果。

6、对淋巴细胞进行：体外刺激预孵育、或板内同步刺激培养应如何操作？

（1）将抗原和淋巴细胞在体外混合，刺激并预孵育，是通用的方法。预孵育的淋巴细胞，在置入ELISPOT板之前应使用复温到37℃的培养液清洗细胞1-2次。置入ELISPOT板以后通常在37℃培养5～6小时。 2）对于高度特异性抗原，可以采用将淋巴细胞和抗原同时加入ELISPOT板孔中，37℃培养箱中，同步进行刺激、培养、和细胞因子捕获。淋巴细胞板内同步刺激培养的时间通常为22～24小时。

7、在ELISPOT细胞培养过程中，我可以随时对ELISPOT板进行观察吗？

ELISPOT试验检测的是每一个分泌细胞因子的活化细胞。在培养细胞过程中，任何移动、震动（包括开关培养箱门）都会导致细胞在培养板上的移动，从而得到不规则斑点或者斑点花纹，影响最终结果。因此细胞在ELISPOT培养板孵育的过程中，应注意保持培养板的静置，不应对其移动。

8、在使用抗原刺激淋巴细胞培养过程中，我发现培养液变黄，有什么影响？

这种现象通常见于使用很强的多克隆抗原刺激淋巴细胞，某些多克隆抗原会导致淋巴细胞凋亡或者死亡，大量淋巴细胞死亡后使培养液变黄。使用这些淋巴细胞进行后续ELISPOT试验通常得到很低的斑点（SPOT）形成。换用特异性抗原后可以避免该现象。

9、在ELISPOT结果中出现：不规则的大块斑点，有的区域没有斑点是什么原因？

不规则斑点区域的出现一般是细胞分离不完全所至，有时候采用多克隆抗原孵育的淋巴细胞也会产生成团现象。请确认加入到ELISPOT板中进行孵育的是单细胞悬液。

10、用于ELISPOT试验中操作细胞的吸头有什么要求？

请使用开口较大的吸头，动作轻柔，避免对细胞的吹打，减少剪切力对淋巴细胞的伤害。

三、ELISPOT培养板的选用

1、目前有什么类型的ELISPOT板？

ELISPOT板的主要生产商如：U-CyTech， Millipore， Nunc， BD， Whatman等。目前生产的ELISPOT板包括透明，不透明（白色），PVDF膜等多种类型的板。

2、达科为公司对使用各种类型的板有什么建议？

国外主要生产商所生产的各类型ELISPOT板都能良好的进行ELISPOT试验。达科为公司不推荐使用PVDF膜ELISPOT板。其原因有以下方面

（1）PVDF膜在使用中容易因为温度、湿度、干燥、外力等原因产生局部皱褶，变形影响试验结果。

（2）PVDF膜在使用时需非常小心，以免被加样枪头刺破膜。

（3）PVDF培养板底部不透光源，在检测的过程中无法随时观察细胞状态。

（4）PVDF膜在实验过程中清洗困难，洗涤的不充分往往造成背景过重影响实验结果的显示。

3、达科为公司推荐使用哪种类型的板？

达科为公司通过多年的实验室操作经验，推荐使用荷兰U-CyTech公司的透明ELISPOT培养板。该透明ELISPOT培养板的检测结果可以很方便的在倒置显微镜（普通的细胞室所具有的设备）下观察计数、或者采用酶联斑点自动图像分析仪分析。同时承载实验的培养板坚固耐用，容易清洗，不存在被加样枪头损坏的危险，使整个实验操作更为方便轻松。U-CyTech公司ELISPOT系统采用独特的黑色酶底物系统，显色系统非常灵敏并且稳定性更强，结果的保存期在6个月以上。

4、我需要对ELISPOT板预先进行消毒处理吗？

U-CyTech公司提供的透明ELISPOT培养板预先进行了无菌处理。因此在包装未破损的情况下不需进行消毒处理。不过在细胞培养过程中还是应该注意无菌操作。

5、显色后的板经过干燥可以保存多长时间？

红色或者蓝色斑点PVDF膜板经过干燥后可保存六个月。黑色斑点透明板干燥后可保存延长至两年。建议一定要避光保存。