双抗体夹心ELISA法检测待测样品sTNF-α含量
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双抗体夹心ELISA法检测待测样品sTNF- α 含量
【基本原理】
选用两株针对TNF-α分子不同位点的单克隆抗体，即McAb1 （包被抗体）与McAb2 （酶标抗体）。先用McAb1 包被固相载体，使待测sTNF-α与之特异性结合，然后再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的McAb2 ，则形成McAb1 -sTNF-α -HRP标记McAb2 复合物，再加入HRP底物，则酶催化底物显色，测定样品与标准品光密度值（即OD值），绘制标准曲线，即可从标准曲线中查得待测样品中sTNF-α含量。
【试剂及配制】
（1） 包被抗体McAb1 ：使用时用包被液作适当稀释（如1：100）。
（2） 酶标抗体McAb2 ：以辣根过氧化物酶（HRP）标记。使用时用稀释液作适当稀释，其稀释度根据预试验结果而定。
（3） rhuTNF-α标准品：已知含量的rhuTNF-（10ng/ml），使用时用稀释液作倍比稀释成7个浓度：5 ng/ml，2.5 ng/ml，1.25 ng/ml，625pg/ml，312 pg/ml，156 pg/ml，78 pg/ml。
（4） 待测样品：如血清、血浆、尿液、细胞培养上清液等均可用于sTNF-α ，后者应作适当稀释。
（5） 阴性对照品：未免疫小鼠IgG。
（6） PBS（0.01mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液）
（7） 包被液（0.05mol/L，ph9.6碳酶盐缓冲液）
（8） 洗涤液（0.05%Tween-20-PBS）
（9） 稀释液（含2% PEG的洗涤液或含10% BSA的PBS）：稀释液主要用来酶标McAb2 和标准品rhaTNFα。2% PEG洗涤液的配制：2.9g Nacl，2.0g PEG(MW6000)，0.6ml鸡蛋清溶于100ml PBS中。
（10） 底物缓冲液（0.1mol/L，pH5.0的柠檬酸盐缓冲液）：称取1.79g Na2 HPO4 ・12H2 O和1.29g柠檬酸，溶解至100ml双蒸水。
（11） 底物液（显色液）：将5mg ABTS或10mg OPD 溶于 10ml底物缓冲液中，加入20μl 3% H2 O2 （临用前配制）。
（1） 终止液（2mol/L的H2 SO4 ）：量取20ml 98% H2 SO4 ，缓缓加至80ml 双蒸水中即可。
（2） 96孔酶标板（96孔ELISA板），酶标测定仪，495nm滤光片。
（3） 其他：4℃冰箱，水浴箱，刻度吸管 ，毛细吸管 ，加样器（头）等。
【操作步骤】
（1） 包被：将用包被液稀释好的McAb1 加入96孔酶标反应板，100μl /孔，置37℃温育2h后再移置4℃过夜（16-72h）；
（2） 洗涤：将96孔酶标板倾去包被液，用洗涤液加满各孔，置室温3min，然后倾去。反复洗涤3次。
（3） 加样（均设双复孔）。
①将已知含量rHuTNF-α标准品用稀释液作倍比稀释后，分别加入1～7孔，100μl/孔，按浓度从低到高的顺序依次加样；
②8孔加入待测样品，100μl；
③9孔加阴性对照血清（未免疫小鼠IgG），100μl；
④10孔为空白对照（稀释液），100μl/孔；
（4） 加样后，置37℃孵育1～2h。洗涤3次，方法同前；
（5） 各孔加入HRP标记的McAb2 ，用稀释液作适当稀释，其稀释度根据预试验结果而定，100μl/孔；
（6） 置37℃孵育1～2h；
（7） 洗涤3次，方法同前；
（8） 显色：各孔加新鲜配制的ABTS显色液（或OPD-H2 O2 显色液），100μl/孔，置室温或37℃下避光反应15-30min
（9） 终止反应：各孔加入终止液2mol/L H2 SO4 ，50μl/孔；
（10） 测定OD值：用酶标测定仪，以波长495nm测定各孔OD值。
【结果分析】
（1） 空白对照及阴性对照孔应无色，各阳性孔呈现棕黄色，且rhuTNF-α标准品各孔呈明显颜色由浅到深梯度。
（2） 绘制标准曲线：以标准品各稀释度rhuTNF-α含量为横座标（X），相应的OD值为纵座标（Y），在普通座标纸上绘制标准曲线。
（3） 根据待测样品孔所测得的OD值，在标准曲线上查得样品中sTNF-α含量。
【注意事项】
（1） 血清或血浆中残存的凝块或红细胞须经离心去除，匆用溶血或血脂过多的血清检测TNF-α含量。
（2） 待测样品在2-8℃可放置3d，超过3d应放入-20℃或-70℃冰箱，且应避免反复冻融，宜分装保存。
（3） TNF-α标准品的质量直接影响待测样品结果的准确性，应注意商品试剂盒中的标准品可随时间延长而效价降低。
（4） 分别用加样器头吸取各份标本，避免相互交叉使用。
（5） 叠氮钠（NaN3 ）对辣根过氧化物酶有灭活作用，在本实验系统中应避免使用。
（6） 底物显色液应在临用前配制，置4℃避光保存，H2 O2 应置2-8℃，保存6个月以内。加入底物显色15-30min后应立即测定OD值。
（7） 应避免反应孔中有气泡，以免影响所测OD值的准确性。
（8） 用不同来源的样品、不同实验室所测得的TNF-α含量不同，正常值标准也难于统一。可进行大样本测定，以X+ 2SD确定自己实验室各种来源检测样品的TNT-α正常值范围。一般ELISA法测定血清标本时，TNF-α参考值范围为4.3+ 2.8μg/L(或4.3+ 2.8ng/ml)。
