备选方案3：双抗体夹心ELISA法检测特异性抗体

一、附加材料（其他材料见基本方案）

包被抗体溶液（特异性针对待测种属免疫球蛋白的抗体，不结合抗原或标记抗体）

碱性磷酸酶标记的针对抗原的特异性抗体

二、实验方法

1. 用50ul的2ug/ml或lOug/ml包被抗体溶液包被Immulon微量滴定板，并封闭板孔 （见基本方案，步骤2〜5）。用较低浓度分析杂交瘤上清液或腹水，较高浓度用于分 析抗血清。

2. 用封闭缓冲液按1 : 5或1 : 200 （V/V）分别稀释杂交瘤上清液、抗血清或腹水，配 制待测抗体溶液。在已包被孔中加入50u1，室温下孵育2h以上，洗涤（见基本方案，步骤7）。

3. 用封闭缓冲液配制20〜200ng/ml的抗原溶液。往抗体包被孔中加入50ul等量抗原 溶液，室温下孵育2h以上，洗涤。

4. 板孔中加入50ul碱性磷酸酶标记的针对抗原的特异性抗体（通常是25〜500ng 特异性抗体/ml），室温下孵育2h，洗涤。

   酶标抗体浓度应足够高，保证NPP为底物时在405nm下产生大约0.50吸光度 单位/h的光强度，或MUP为底物时产生1000〜1500荧光吸光度单位/h。应注意在 可得到试剂条件下设置阳性对照系统。这种试剂可在Linscott’s Directory of Immunological and Biological Reagents 今查知。

5. 每孔中加入75ul MUP或NPP底物溶液，室温下孵育lh。然后，目测检查酶解作用 或用分光光度计定量测定（见基本方案，步骤9）。如要检测低水平反应，酶解作用 数小时或数天后再次测定。

6. 检测出的抗原特异性抗体应重新筛选以确定是否为假阳性。每个阳性样本中，用捕 获抗体包被4个板孔，并将待测抗体和包被抗体结合在一起（步骤1和2）。用抗原孵育2孔（步骤3），另2孔用封闭缓冲液封闭，4孔内都加入酶标抗体和底物（步骤4和5），1h后检测显色反应。