简介
琼脂糖凝胶电泳法是判断细胞凋亡的经典方法。凋亡细胞在发生凋亡时，可产生多个大小 在 180 - 200 bp 或其多聚体组成的寡核昔酸片断，这些片段在进行琼脂糖凝胶电泳时，形成了特征性的梯状条带 (DNA ladders)，其大小为 180 - 200 bp 的整数倍。
原理
琼脂糖凝胶电泳法检测细胞凋亡的基本原理是凋亡细胞 DNA 片段在核小体单位之间连接处断裂，形成 180～200bp 整数倍的寡核苷酸片段，在琼脂糖凝胶电泳图谱上表现为阶梯状条带（DNA ladder）。
坏死细胞内的 DNA 则是被随机降解为任意长度的片段，其 DNA 降解产物在电泳图谱上呈现弥漫的条带。对凋亡细胞采用常规方法分离提纯 DNA 后，进行琼脂糖凝胶电泳和溴化乙啶（ethidium Bromide，EB）染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的 DNA ladder。
材料与仪器
器材：CO2 培养箱、生物安全柜、水平电泳槽及电泳仪、恒温水浴箱、正视显微镜及离心机、凝胶图像分析系统。
试剂：
① 含 10％ FBS 的 RPMI 1640 培养液。
② 地塞米松磷酸钠注射液。
③ 1 kb plus DNA ladder。
④ 细胞裂解液（10 mmol/L Tris-HC1，pH8.0，10 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，100μg/ml 蛋白酶 K，10 mg/ml Rnase,1% SDS)。
⑤ 苯酚/氯仿（1:1）、苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）、氯仿。
⑥ 3mol/L 乙酸钠，pH5.2。
⑦ -20℃ 预冷的无水乙醇。
⑧ TE 缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl pH8.0,1 mmol/L
⑨ 100bp Ladder Marker。
⑩ 50 x TAE 电泳缓冲液（Tris 242 g，醋酸 57.1 ml，0.5mol/L EDTA，pH8.0 100 ml，加蒸馏水至 1L）。
⑪ 低熔点琼脂糖
步骤
琼脂糖凝胶电泳法检测细胞凋亡的的基本过程可分为如下几步，以检测小鼠脾细胞凋亡为例：
（一）DNA 提取
A 脾细胞分离：4 周龄 Balb/c 小鼠经麻醉后处死，无菌条件下取出脾脏，经机械研磨游离胸脾细胞，用预冷的裂解液将红细胞溶解，用 PBS 将脾细胞洗涤，最后悬浮于 10％ FBS 的 RPMI 1640 培养液中，密度为 2x106/ml。
B 实验分组：凋亡组，于 6 孔细胞培养板中加胸腺细胞液 2 ml，加地塞米松溶液，补加含 10％ FBS 的 RPMI 1640 培养液至总体积 4 ml，地塞米松终浓度为 1μmol/L。混匀后，于 37℃、5％ CO2 的细胞培养箱中培养 10 小时。阴性对照组，细胞培养液中不加地塞米松。
C 分别收集各组细胞，以 PBS 洗 1 次，800 g 离心 5 分钟。弃上清，加含蛋白酶 K 和 RNase 的细胞裂解液 500μl，混匀，50℃ 水浴 2 小时，不时振摇。以等体积的苯酚/氯仿（1:1）、苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）和氯仿各抽提一次。
D 收集上清移至另一离心管，加 0.5 ml 氯仿：异戊醇（24:1）抽提，混匀后 4℃、12000 r/min 离心 5 分钟。
E 移上清至另一离心管，加 100μl 的 3mol/L 乙酸钠和 1 ml 预冷无水乙醇，混匀后置-20℃ 过夜沉淀 DNA，4℃、12000 r/min 离心 10 分钟离心弃上清。
F 沉淀重新悬浮于 70％ 乙醇，4℃、12000 r/min 离心 10 分钟，弃上清。置室温干燥 10 - 30 分钟，加 30μl TE 缓冲液溶解 DNA。于 260nm 和 280nm 测定 DNA 含量。
（二）电泳
A 制备含 EB（终浓度 0.2 μg/ml）的 1.6％ 的琼脂糖凝胶，将胶移入到 1xTAE 缓冲液的电泳槽内。
B 取 5μl 样品溶液与等体积加样缓冲液混匀，依次上样，以 10V/cm 电泳 2 - 3 小时。
C 以双水脱色 1 小时，在紫外灯下观察。置凝胶成像系统中拍照分析。
（三）观察结果
凋亡细胞 DNA 提取物在电泳后呈现典型的 DNA 阶梯状条带，正常细胞 DNA 提取物在点样附近呈现出一条宽带，坏死细胞则为弥散状条带（图 19-4）。
注意事项
1．细胞裂解液中要有足够的蛋白酶 K 和 RNA 酶，消化时间可适当延长，使蛋白及 RNA 充分降解。RNA 酶经高温预处理灭活 DNA 酶。
2．加氯仿等提取液时要快速剧烈混匀，有利于蛋白变性沉淀。氯仿及苯酚具有一定的挥发性，对身体有一定的危害，操作时应在通风橱中进行。
3．电泳时上样量一定要合适，否则量少跑不出条带，量多则荧光太强条带分辨不清。
4．EB 具有潜在的致畸作用性，操作时要戴乳胶手套，注意防护。
来源：丁香实验
