合作专家 | 杨宏清硕士
兽医学 云南农业大学
审核专家 | 李娜硕士
生理学 大连医科大学
简介
小鼠 SOD 测定采用酶联免疫吸附试验(ELISA)。通过双抗体一步夹心法,在包被 SOD 抗体的 96 孔板中,加入标本、标准品、HRP 标记的检测抗体,通过恒温培养箱温育并彻底洗涤。
加入底物 TMB 显色,TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的 SOD 正相关,用酶标仪在 450 nm 波长下测定吸光度(OD 值),计算样品浓度。
材料与仪器
试验样品、移液枪、酶标仪、恒温培养箱、小鼠超氧化物歧化酶(SOD)ELISA 检测试剂盒等。
步骤
1、样品收集及处理
小鼠血清:使用不含热源和内毒素的试管,收集血液后,于 3 000 rpm/min 离心 10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
血浆:用肝素钠润湿洁净的 EP 管,收集血液,3 000 rpm/min 离心 10 分钟后,小心收集上清。
组织匀浆:取小鼠组织,加入适量生理盐水捣碎,3 000 转离心 10 分钟取上清。
细胞培养上清:1)检测分泌型因子,收集细胞上清,2 000~3 000 rpm/min 离心 20 分钟后收集上清;2)检测细胞内的因子,用液氮反复冻融细胞促使细胞破坏并释放出细胞内因子。2 000~3 000 rpm/min 离心 20 分钟,收集上清。
如不及时检测,冻存于 -20 ℃ 时,要检测时在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
2、试剂盒保存
小鼠超氧化物歧化酶(SOD)ELISA 检测试剂盒保存在 2~8 ℃,使用前室温平衡 20 分钟。
3、试剂准备
按试剂盒说明书配制洗涤缓冲液按 1 :20 稀释,即 1 份 20 x 洗涤缓冲液加 19 份的蒸馏水。
4、检测步骤
1)将室温平衡 20 min 后板条取出,剩余自封袋密封放回 4 ℃。
2)设置标准品孔、样本孔和空白孔,标准品孔各加不同浓度的标准品 50 μL。
3)若检测因子在样本含量过高,则需要稀释样本,即样本孔先加待测样本 10 μL,再加样本稀释液 40 μL;若否,则样本孔先加待测样本 50 μL。空白孔不加。
4)除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入 HRP 标记的检测抗体 100 μL,用封板膜封住反应孔,37 ℃ 封恒温箱温育 1 h。
5)弃去液体,在吸水纸上拍干并加洗涤液,静置 1 min,甩去洗涤液后拍干,重复洗板 5 次。
6)每孔加入底物 A、B 各 50 μL,37 ℃ 避光孵育 15 min。
7)每孔加入终止液 50 μL,15 min 内,在 450 nm 波长处测定各孔的 OD 值。
5、结果判断
绘制标准曲线,以标准品浓度作横坐标,对应 OD 值做纵坐标,绘制出标准品线性回归曲线,按曲线方程计算各样本浓度值。
注意事项
1. 样品准备时离心速度大,导致溶血。
2. 检测试剂盒未在室温完全溶解后就使用。
3. 未按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
4. 液体试剂使用前未充分摇匀。
来源:丁香实验