双抗夹心 ELISA 法

先将抗体包被于反应板上，加入待测抗原，然后再加入酶标抗体，显色后即可测得抗原含量。

抗体；
碳酸盐缓冲液、Na₂CO³、磷酸盐缓冲液、NaCl、KCl、TMB、二甲基亚砜、牛血清蛋白；
酶标仪、培养箱；

一、材料准备

1、包被液：0.05 mol/l（pH9.6）碳酸盐缓冲液：Na₂CO₃ 0.159 g，NaHCO₃ 0.294 g，用蒸馏水溶解后，定容至 100 ml。

2、PBS-T 洗涤液：0.01mol/ pH7.4 磷酸盐-氯化钠缓冲液：NaCl 8.0 g，KH₂PO₄ 0.2 g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9 g，KCl 0.2 g，吐温-20 0.5 ml，用蒸馏水溶解后，定容至 1000 ml。

3、底物溶液 3，3’，5,5‘-四甲基联苯胺（TMB）贮存液及应用液：

（1）0.1 mol/l pH6.8 PBS：Na₂HPO₄·12H₂O 1.09 g，NaH₂PO₄·H₂O 6.05 g，蒸馏水溶解后定容至 500 ml，4℃ 保存备用。

（2）TMB 贮备液：TMB 60 mg 溶于 10 ml 二甲基亚砜（DMSO）中 4℃ 保存备用。

（3）TMB 应用液：临用前取 0.1 mol/l pH6.0 PBS 10 ml，TMB贮备液 100 ul，30%H₂O₂ 15 ul 混匀即可。

二、实验步骤

1、抗体包被

（1）抗体用包被液稀释至 20 ug/ml，加入聚苯乙烯反应板中每孔 100 ul，加盖后放 4℃ 过夜。

（2）倾去孔内液体，加入洗涤液后静置 3 min，倾尽洗涤液，重复洗涤 3 次。

（3）将反应板口在吸水纸上，以除尽液体。

2、封闭：每孔加入 200 ul 封闭液，37℃ 孵育 60 min，然后洗涤 3 次。

3、加入待测血清，37℃ 温育 1~2 h，洗涤 3 次。用稀释液作对照孔，标准曲线的制备是用不容稀释度的纯 GST-π。

4、加酶标抗体：按要求稀释抗 GST-π-IgG-HRP，每孔 100 ul，37℃ 温育 1 h，然后洗涤 5 次，扣在吸水纸上吸干水分。

5、显色：加入 TMB 应用液，置室温反应 15~30 min，加入 50 ul 2 mol/l H₂SO₄，稳定 3~5 min，即可比色。

6、比色：用酶标仪，以 PBS-T 孔为对照，波长 450 nm，测各孔光吸收度（A），查标准曲线，即可测得 GST-π 含量。

外观性状：白色或几乎白色结晶性粉末或无色的结晶。

溶解度：易溶于水，微溶于96%乙醇及二氯甲烷。

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