原理
先将康体包被于反应板上,加入待测抗原,然后再加入酶标康体,显色后即可测得抗原含量。
材料与仪器
抗体
碳酸盐缓冲液 Na2CO3 磷酸盐缓冲液 NaCl KCl TMB 二甲基亚砜 牛血清蛋白
酶标仪 培养箱
碳酸盐缓冲液 Na2CO3 磷酸盐缓冲液 NaCl KCl TMB 二甲基亚砜 牛血清蛋白
酶标仪 培养箱
步骤
一、材料准备
1. 包被液:0.05 mol/l(pH9.6)碳酸盐缓冲液:Na2CO3 0.159 g,NaHCO3 0.294 g,用蒸馏水溶解后,定容至100 ml。
2. PBS-T洗涤液:0.01mol/ pH7.4磷酸盐-氯化钠缓冲液:NaCl 8.0 g,KH2PO4 0.2 g,Na2HPO4·12H2O 2.9 g,KCl 0.2 g,吐温-20 0.5 ml,用蒸馏水溶解后,定容至1000 ml。
3. 底物溶液3,3’,5,5‘-四甲基联苯胺(TMB)贮存液及应用液:
(1)0.1 mol/l pH6.8 PBS:Na2HPO4·12H2O 1.09 g,NaH2PO4·H2O 6.05 g,蒸馏水溶解后定容至500 ml,4℃保存备用。
(2)TMB贮备液:TMB 60 mg 溶于10 ml 二甲基亚砜(DMSO)中4℃保存备用。
(3)TMB应用液:临用前取0.1 mol/l pH6.0 PBS 10 ml,TMB贮备液100 ul,30%H2O2 15 ul 混匀即可。
二、实验步骤
1. 抗体包被
(1)抗体用包被液稀释至20 ug/ml,加入聚苯乙烯反应板中每孔100 ul,加盖后放4℃过夜。
(2)倾去孔内液体,加入洗涤液后静置3 min,倾尽洗涤液,重复洗涤3次。
(3)将反应板口在吸水纸上,以除尽液体。
2. 封闭:每孔加入200 ul封闭液,37℃孵育60 min,然后洗涤3次。
3. 加入待测血清,37℃温育1~2 h,洗涤3次。用稀释液作对照孔,标准曲线的制备是用不容稀释度的纯GST-π。
4. 加酶标抗体:按要求稀释抗GST-π-IgG-HRP,每孔100 ul,37℃温育1 h,然后洗涤5次,扣在吸水纸上吸干水分。
5. 显色:加入TMB应用液,置室温反应15~30 min,加入50 ul 2 mol/l H2SO4,稳定3~5 min,即可比色。
6. 比色:用酶标仪,以PBS-T孔为对照,波长450 nm,测各孔光吸收度(A),查标准曲线,即可测得GST-π含量。
1. 包被液:0.05 mol/l(pH9.6)碳酸盐缓冲液:Na2CO3 0.159 g,NaHCO3 0.294 g,用蒸馏水溶解后,定容至100 ml。
2. PBS-T洗涤液:0.01mol/ pH7.4磷酸盐-氯化钠缓冲液:NaCl 8.0 g,KH2PO4 0.2 g,Na2HPO4·12H2O 2.9 g,KCl 0.2 g,吐温-20 0.5 ml,用蒸馏水溶解后,定容至1000 ml。
3. 底物溶液3,3’,5,5‘-四甲基联苯胺(TMB)贮存液及应用液:
(1)0.1 mol/l pH6.8 PBS:Na2HPO4·12H2O 1.09 g,NaH2PO4·H2O 6.05 g,蒸馏水溶解后定容至500 ml,4℃保存备用。
(2)TMB贮备液:TMB 60 mg 溶于10 ml 二甲基亚砜(DMSO)中4℃保存备用。
(3)TMB应用液:临用前取0.1 mol/l pH6.0 PBS 10 ml,TMB贮备液100 ul,30%H2O2 15 ul 混匀即可。
二、实验步骤
1. 抗体包被
(1)抗体用包被液稀释至20 ug/ml,加入聚苯乙烯反应板中每孔100 ul,加盖后放4℃过夜。
(2)倾去孔内液体,加入洗涤液后静置3 min,倾尽洗涤液,重复洗涤3次。
(3)将反应板口在吸水纸上,以除尽液体。
2. 封闭:每孔加入200 ul封闭液,37℃孵育60 min,然后洗涤3次。
3. 加入待测血清,37℃温育1~2 h,洗涤3次。用稀释液作对照孔,标准曲线的制备是用不容稀释度的纯GST-π。
4. 加酶标抗体:按要求稀释抗GST-π-IgG-HRP,每孔100 ul,37℃温育1 h,然后洗涤5次,扣在吸水纸上吸干水分。
5. 显色:加入TMB应用液,置室温反应15~30 min,加入50 ul 2 mol/l H2SO4,稳定3~5 min,即可比色。
6. 比色:用酶标仪,以PBS-T孔为对照,波长450 nm,测各孔光吸收度(A),查标准曲线,即可测得GST-π含量。
注意事项
性状
外观性状:白色或几乎白色结晶性粉末或无色的结晶。
溶解度:易溶于水,微溶于96%乙醇及二氯甲烷。
常见问题
谷胱甘肽具有广谱解毒作用,不仅可用于药物,更可作为功能性食品的基料,在延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤等功能性食品广泛应用。
来源:丁香实验