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双抗夹心ELISA法

相关实验:谷胱甘肽的测定实验

最新修订时间:

原理

先将康体包被于反应板上,加入待测抗原,然后再加入酶标康体,显色后即可测得抗原含量。

材料与仪器

抗体
碳酸盐缓冲液 Na2CO3 磷酸盐缓冲液 NaCl KCl TMB 二甲基亚砜 牛血清蛋白
酶标仪 培养箱

步骤

一、材料准备

1.  包被液:0.05 mol/l(pH9.6)碳酸盐缓冲液:Na2CO0.159 g,NaHCO0.294 g,用蒸馏水溶解后,定容至100 ml。

2.  PBS-T洗涤液:0.01mol/ pH7.4磷酸盐-氯化钠缓冲液:NaCl 8.0 g,KH2PO4 0.2 g,Na2HPO4·12H2O 2.9 g,KCl 0.2 g,吐温-20 0.5 ml,用蒸馏水溶解后,定容至1000 ml。

3.  底物溶液3,3’,5,5‘-四甲基联苯胺(TMB)贮存液及应用液:

(1)0.1 mol/l pH6.8 PBS:Na2HPO4·12H2O 1.09 g,NaH2PO4·H2O 6.05 g,蒸馏水溶解后定容至500 ml,4℃保存备用。

(2)TMB贮备液:TMB 60 mg 溶于10 ml 二甲基亚砜(DMSO)中4℃保存备用。

(3)TMB应用液:临用前取0.1 mol/l pH6.0 PBS 10 ml,TMB贮备液100 ul,30%H2O2 15 ul 混匀即可。

二、实验步骤

1.  抗体包被

(1)抗体用包被液稀释至20 ug/ml,加入聚苯乙烯反应板中每孔100 ul,加盖后放4℃过夜。

(2)倾去孔内液体,加入洗涤液后静置3 min,倾尽洗涤液,重复洗涤3次。

(3)将反应板口在吸水纸上,以除尽液体。

2.  封闭:每孔加入200 ul封闭液,37℃孵育60 min,然后洗涤3次。

3.  加入待测血清,37℃温育1~2 h,洗涤3次。用稀释液作对照孔,标准曲线的制备是用不容稀释度的纯GST-π。

4.  加酶标抗体:按要求稀释抗GST-π-IgG-HRP,每孔100 ul,37℃温育1 h,然后洗涤5次,扣在吸水纸上吸干水分。

5.  显色:加入TMB应用液,置室温反应15~30 min,加入50 ul 2 mol/l H2SO4,稳定3~5 min,即可比色。

6.  比色:用酶标仪,以PBS-T孔为对照,波长450 nm,测各孔光吸收度(A),查标准曲线,即可测得GST-π含量。

注意事项

性状


外观性状:白色或几乎白色结晶性粉末或无色的结晶。


溶解度:易溶于水,微溶于96%乙醇及二氯甲烷。

常见问题

谷胱甘肽具有广谱解毒作用,不仅可用于药物,更可作为功能性食品的基料,在延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤等功能性食品广泛应用。

来源:丁香实验

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