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捕获ELISA法

丁香园

7348

第1节- 试剂

1.1涂层缓冲液

PBS(137 mM氯化钠,2.7 mM的氯化钾,8.1 mM的磷酸氢二钠,1.5 mM磷酸二氢钾)

1.2封闭液

5%脱脂乳于PBST中(0.05%Tween-20)

1.3稀释剂

2%脱脂乳于PBST中(0.05%Tween-20)

1.4柠檬酸缓冲液

3.65克柠檬酸,4.76克磷酸氢二钠,溶解于500毫升双蒸水

1.5兔抗GST抗体

兔抗GST抗体

1.6 HRP结合山羊抗兔IgG(H + L)

山羊抗兔IgG(H + L),結合过氧化物酶

第2节- 分析方法

注:以下方法是一个指南,用户需要确定自己的最佳实验条件以获取最好的成果。

2.1经由加入具有抗原特异性的抗体到适当的孔(1微克/孔)以加入捕获抗体,浓度应为10微克/毫升于涂层缓冲液中,量应为100μL/孔。※捕获抗体应该是纯化的抗体。

2.2在4℃下孵育孔盘过夜。

2.3加入250μl封闭液到每个孔中。

2.4孵育孔盘于室温下1小时。

2.5清空孔盘,用PBST(0.05%Tween-20)洗涤孔盘一次。

2.6如果待测物为:

A,重组蛋白-以稀释剂稀释待测物至100毫微克,30毫微克,10毫微克,3纳克,1纳克,0.3毫微克,0.1纳克和0.03纳克/毫升。

B,转染裂解液– 以连续稀释倍数进行待测物稀释,以确定可以合适标准曲线的适当稀释倍数。通常使用3X,10X,30X,100X,300X,1000X,3000X在这个步骤。

2.7待测物添加到适当的孔中。

2.8孵育盘于室温下2小时。

2.9清空孔盘,然后用PBST(0.05%Tween-20)洗涤孔盘三次。

2.10加入检测抗体加入标记特异性的兔抗GST抗体的适当的孔中(2.5微克/毫升,100 μL/孔)。

2.11孵育孔盘于室温下2小时。

2.12清空孔盘,然后用PBST(0.05%Tween-20)洗涤孔盘三次

2.13加入第二抗体的方式为加入HRP结合的山羊抗兔IgG(H + L)于适当的孔中。

2.14孵育孔盘于室温下1小时。

2.15用PBST(0.05%Tween-20)洗涤孔盘五次,。

2.16加入入150微升底物(OPD,400微克/毫升,0.03%过氧化氢,柠檬酸盐缓冲液)

2.17在室温下孵育30分钟。

2.18读取450nm的吸光度。

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