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激光捕获显微切割

相关实验:显微镜技术

别名:laser capture microdissection

最新修订时间:

简介

激光捕获显微切割(laser capture microdissection,LCM)是在显微镜下从组织切片中高选择地分离、纯化单一类型细胞群或单个细胞的新技术,使靶细胞群与转运膜在局部紧密黏合,选择性地捕获目的细胞群。

原理

激光捕获显微切割技术的基本原理是在高倍显微镜下,观察5~20 μm厚的组织切片,依据细胞或组织形态学特征、免疫组化表型,来选择目的细胞。


然后按压与显微镜相连的激光器按钮,激光源发出的一束激光,被激光对应部分的透明乙烯-乙酸乙烯共聚(ethylenevinyl acetate,EVA)膜吸收,温度迅速升至90 ℃左右使膜熔化。


并在激光脉冲结束200ms内瞬间冷却,EVA膜与靶细胞结合,其结合力比靶细胞与载玻片间结合力更强;揭起EVA膜,被捕获的目的细胞即和EVA膜一起脱离切片上的其他组织。


在同一张切片上通过移动组织切片或EVA膜重复进行,捕获点可相互叠加以捕获足够的细胞;然后,连同膜一起放入裂解液,依据不同研究目的提取DNA、RNA、酶或者蛋白质。

用途

激光捕获显微切割技术可用于遗传学和基因表达分析、微阵列分析和蛋白质分析。


1、 遗传学和基因表达分析:具有特征性的技术优势,最初开展的原始创新性研究多用于肿瘤克隆性分析、肿瘤发生和演进过程中各阶段细胞基因改变的比较、肿瘤内酶活性的定量检测等方面。


2、 微阵列分析:美国肿瘤基因组解剖计划(Cancer Genome Anatomy Project,CGAP)由美国国立癌症研究机构在1998年发起的,目的是建立cDNA文库,该文库囊括细胞中正在表达的所有基因。


LCM已成为CGAP的主要支撑技术,用来捕获正常、癌前病变阶段和癌细胞作为文库的源细胞。以LCM为支持技术的组织病变的分子分析,通过对不同时空组织标本特殊细胞捕获,并鉴定比较基因表达模式差异,可为研究任何疾病进程提供重要信息,并为疾病诊断和治疗提供分子靶标。


3、 蛋白质分析:激光显微切割技术与二维凝胶电泳和质谱等技术结合是使蛋白质组学研究顺利开展的新的技术方法体系。


通过建立蛋白质“指纹”,发现癌的早期检测、诊断和预后标志物以及用于治疗的蛋白靶标,并希望建立药物早期毒理指纹和鉴定特异性毒性标志物,用以发现药物对机体的影响。

材料与仪器

器材:


石蜡切片,冰冻切片,活细胞或组织涂片,激光捕获显微切割装置。


试剂:无

步骤

激光捕获显微切割技术的基本过程可分为如下几步:


(一)激光显微切割装置的使用方法


A. 开机:依次打开计算机、显微镜和激光器的开关,等待各部件自检完成后,最后打开软件。
B. 启动软件。
C. 放置样品玻片,在弹出的载物台上放置玻片,切割面放在下面。
D. 准备收集器,将装好PCR管的收集器放入载物台下面。
E. 观察样品,选择绘图模式,选定需要切割样品的目的区域,切割选定的区域。
F. 检查切割下的样品,在样品移开、管盖移入视野后,通过智能螺旋(smartmove)的调焦和XY移动旋钮进行检查。
G. 进行图像、数据收集。取出收集器。

H. 关机:首先关软件,然后依次关闭激光器、显微镜和计算机,最后切断总电源。


(二)激光显微切割装置使用练习


标准组织切片不封盖玻片,置于显微镜工作台上,在视野内初步选定取材区域。旋转机械转运臂准确地将表面覆盖有透明热塑性转运膜的塑料帽置于切片的组织标本上。


聚焦激光束,按下激光发射按钮,捕获目的细胞(群)。提起转运臂,连同塑料帽、转运膜、被捕获的目的细胞与切片上的其他组织分离,而周围组织仍在切片上保持完整。将塑料帽、转运膜直接置于含提取液的标准离心管上,以便进行分析。

注意事项

1. 载玻片上的组织不可太干燥,可用二甲苯保持组织的湿度,在切割前使二甲苯蒸发。


2. 采用冰冻组织切片进行显微切割时应注意切片的厚度,一般在4~10 μm为宜。


3. 在切割前可将切片浸在3% 的甘油内30 s,这样可以在切割过程中降低组织的脆性,并且较容易地移取切割下的组织成分。


4. 在每次切割前,应先进行收集器、PCR管盖底观察位置焦面、激光切割的校准,并在空白处进行预切,以检查参数设置是否妥当,更换物镜后应再次检查参数。

来源:丁香实验

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