荧光显微镜技术

一些化学物质经短波高能光激发后能吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量以荧光的形式发射。

荧光发射的特点是在接受能量后即刻引起发光，而一旦停止供能，荧光现象也随之瞬间消失。各种荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱（荧光光谱），即在某一特定波长处有最大吸收峰和最大发射峰，因此要观察不同的荧光应选用不同波长的激发光，得到的荧光强度才能最大。

有些物质能够自发荧光，如维生素A的红色荧光、胶原纤维的蓝绿色荧光、绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的绿色荧光；有些物质不能够自发荧光，用荧光染料染色后，结合物可发出荧光。常用的荧光染料见表1-2。

荧光显微镜比普通光学显微镜多一些附件，如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等。

荧光显微镜采用高压汞灯作光源。汞灯是用石英玻璃制作，中间呈球形，内充一定数量的汞。工作时由两个电极间放电，引起汞蒸发，球内气压迅速升高，当汞完全蒸发时，可达50～70 atm（5～7 MPa），这一过程一般约需5～15 min。

超高压汞灯的发光是电极间放电使汞分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果，它发射紫外到红色各色光，其中强紫外和蓝紫光等短波光足以激发各类荧光物质。

光源发出的光经过激发滤片后，选择性地透过可使标本产生荧光的特定波长的短波激发光，同时阻挡对激发荧光没有用的光，短波激发光激发标本内的荧光物质发射出荧光，通过物镜和目镜放大，同时目镜前的阻断滤片阻挡掉没有被标本吸收的激发光，有选择地透过荧光，从而使观察者通过目镜可观察到清晰的荧光。

目前常用的落射式荧光显微镜的光路图见图1-6。高压汞灯发出的光经激发滤片选择后，激发光经一个与光轴呈45°角的双色束分离器从物镜向下落射到标本表面。

样品被激发产生的荧光以及盖玻片反射的激发光同时进入物镜，荧光可通过双色束分离器进入目镜，反射的激发光被双色束分离器阻挡，少量通过双色束分离器的激发光再被阻断滤片吸收。如换用不同的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的组合插块，可满足不同荧光物质的需要。

器材：

人口腔黏膜上皮细胞临时制片，洁净载玻片，盖玻片，眼科镊，吸水纸，荧光显微镜。

试剂：

②0.01％ 吖啶橙染液

1）0.1 mol／L（pH 7.0）PBS

A液：2.76g N Na₂HPO₄·H₂O，加蒸馏水至100 ml。

B 液：5.36 g Na₂HPO₄·7H₂O，加蒸馏水至100 ml。取16.5 mlA液、33.5 ml B液、8.5g NaCl，用蒸馏水稀释至100 ml。

2））0.1％ 的吖啶橙 0.1 g吖啶橙加蒸馏水100 ml。

荧光显微镜技术的基本过程可分为如下几步：

A. 启动高压汞灯：打开电源开关，当电压稳定在220 V或指示灯变亮后按启动键，汞灯点燃。一般预热10 min后汞灯才能达到最亮点方可观察。

B. 调中光源：应按照使用的荧光显微镜说明书进行操作，最终是通过调节汞灯调中钮使灯影光斑和反射影光斑在载物台的投射平面上居中且重合。光源调中后，显微镜不再移动，以后每次直接放置标本片观察即可。

C. 放置标本片：载玻片厚度应在0.8～1.2 mm之间，太厚的玻片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁、厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。盖玻片厚度在0.17 mm左右，光洁。

D. 先关闭阻光挡板，用普通显微镜光路找到待观察的细胞部位，调节焦距使物像清晰。

2. 高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经15 min汞灯冷却后才能再启动，否则会影响汞灯寿命。

3. 荧光几乎都较弱，应在较暗的室内进行。

4. 高压汞灯散发大量热能。因此，灯室必须有良好的散热条件，工作环境温度不宜太高。

5. 防止紫外线对眼睛的损害，观察过程应戴上防护眼镜。

6. 由于荧光衰减或猝灭，避免长时间在荧光下观察同一部位，暂时不观察时，应用阻光挡板阻挡激发光。

7. 用油镜观察时，应用“无荧光油”。

8. 荧光显微镜光源寿命有限，超过90 min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱，所以每次使用1～2 h，最多不超过2～3 h。

9. 电源最好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。