透射电子显微镜与超薄切片技术

透射电子显微镜技术的基本原理是以电子束作照明源，利用电子流的波动性，经电磁场的作用改变电子前进轨迹，产生偏转、聚焦，因此当电子束透过样品经电磁透镜的作用可放大成像。

高速运动的电子流其波长远比光波波长短，所以电镜分辨率比光镜高。一般光学显微镜放大倍数在数十倍到数百倍，特殊可到数千倍。而透射电镜的放大倍数在数千倍至一百万倍之间，有些甚至可达数百万倍或数千万倍。

由阴极发射的电子经高压加速、聚光镜聚焦形成快速电子流，投射到样品上，与样品中各种原子的核外电子发生碰撞，形成电子散射。细胞质量、密度较大的部位，电子散射度强，成像较暗；质量、密度较小的部位电子散射弱，成像较亮，结果在荧光屏上形成与细胞结构相应的黑白图像。

器材：

平皿，平皿盖，青霉素小瓶，注射器（2～5 ml）

滴管，医用胶布，滤纸，新单面刀片，石蜡（块或片）

新双面刀片，解剖器材，铜网，牙签,透射电子显微镜

超薄切片机、解剖镜、制刀机、冰盒、包埋模具

恒温箱、冰箱、玻璃切片刀或钻石刀

试剂：

②2.5％ 戊二醛:取25％ 戊二醛（市售戊二醛）10 ml。

加0.1mol／L二甲肿酸钠缓冲液至100 ml，装入茶色瓶中，置4 ℃冰箱保存备用。

［也可用0.1 mol／L磷酸缓冲液（pH7.4）配制2.5％ 的戊二醛］。

③0.1 mol／L（pH 7.4）二甲砷酸钠缓冲液:

将10.7 g二甲胂酸钠置于500 ml容量瓶中，先加入约400ml水，振荡使其溶解，用HCl调pH为7.4，加入剩余蒸馏水，4℃冰箱保存。

1）配制2％ 锇酸贮存液 取1 g安瓿的四氧化锇，置清洁液中浸泡48 h，后冲洗48 h，双蒸水漂洗30 min。

干后用玻璃刀刻痕1～2道，置于棕色磨口瓶中，加入0.1 mol／L二甲砷酸钠缓冲液50 ml，用力摇动使安瓿破碎。

用蜡严密封口，放置干燥器中；静置48 h锇酸溶解；4 ℃避光保存，备用。

2）配制1％ 锇酸使用液（现用现配）取2％ 锇酸贮存液10 ml，加入0.2 mol／L二甲砷酸钠缓冲液（pH7.3）10 ml，混合即可。

⑤30％、50％、70％ 乙醇溶液。

⑥80％、90％、95％ 丙酮溶液，100％ 丙酮溶液，3：1的100％丙酮溶液与包埋剂的混合液，1：1的100％ 丙酮溶液与包埋剂的混合液，1：3的100％ 丙酮溶液与包埋剂的混合液。

⑦环氧树脂（Epon812）包埋剂

MNA（甲基纳迪克酸酐，硬化剂） 8.9 ml

使用时，A液和B液按一定比例混合后，逐滴加入1.5％ 的DMP-30［2,4,6-三（二甲基氨基甲基）苯酚］，边加边搅拌，持续20 min左右。一般A液和B液混合比例：冬季1：9；夏季2：8。

⑧醋酸铀染液:称取醋酸双氧铀1.54 g，溶于20 ml的50％ 或70％ 的乙醇（pH3.8）中，充分溶解后过滤，4 ℃冰箱避光保存。

⑨柠檬酸铅染液: 称取硝酸铅1.33 g、柠檬酸钠1.76 g

置入50ml容量瓶中加双蒸水（用前沸煮5min，冷却后用）

30ml，振摇约30min，至呈现乳白色悬液

加1mol／L NaOH 8ml；加双蒸水至50ml、混匀（pH为12）。

透射电镜生物标本常规超薄切片术，以家兔肝脏为例介绍制作过程及方法：

A. 取材：将活兔用乙醚轻微麻醉，迅速打开腹腔，暴露肝脏，用锋利的双面刀片切取小于1 mm3肝组织，立即投入固定液中。取材过程要求迅速，通常将动物麻醉后取材，如处死后取材，要在1～2 min内完成；其过程在低温（0～4 ℃）下进行，以防止动物死后胞因缺氧发生超微结构的变化。

B. 固定：投入到2.5％ 戊二醛中的肝组织，4 ℃固定2 h；用二甲胂酸钠缓冲液（0.1 mol／L、pH7.4）洗3次，每次10 min；然后放入1％ 锇酸中，4 ℃固定2 h。固定是利用化学试剂使细胞的细微结构或化学成分保持生前状态。

①漂洗：将锇酸固定后的标本取出，用滤纸吸干液体，再用双蒸水漂洗3次，每次10 min。

②脱水：经漂洗后的标本，按顺序投入到30％、50％、70％的乙醇中，4 ℃下各10 min；然后在室温下，投入到80％、90％、95％ 的丙酮中各10 min，2份100％ 的丙酮中各1次，每次各10 min。

用脱水剂把组织细胞内的游离水去除，使包埋剂能够均匀地渗入细胞内。（如实验需中途停顿可把标本放在70％ 的乙醇中过夜）。

D. 浸透：在室温或37 ℃下，将标本分别置入3：1、1：1和1：3的100％ 丙酮与包埋剂混合液中，时间分别为10～30 min、30～60 min和1～2 h或过夜；再置入纯包埋剂中，2～5 h或过夜。其目的是用包埋剂置换出标本中的丙酮。

E. 包埋与聚合：取清洁干燥的包埋模具（如2号药用胶囊），先用注射器向胶囊中滴一滴包埋剂，后用牙签将标本挑入胶囊中，使标本位于液面中央，再向胶囊中缓缓注满包埋剂。

电镜生物标本常用环氧树脂作包埋剂，聚合后可切成超薄切片，并耐受电子束轰击。将包埋好的标本放入温箱中聚合，使包埋剂固化。固化过程一般在37℃处理12 h、45 ℃处理12 h、60 ℃处理24 h；也可直接放入60 ℃温箱中处理24 h。

目的是使包埋剂聚合、硬化，由流体变为均匀的固体。在切片时，其内包埋的肝组织能够保持结构不变。包埋块一般可长期保存。

F. 超薄切片：普通透射电子显微镜的加速电压多为70～100 kV。电子束常难以穿透较厚的组织切片，而医学生物材料的超薄切片在50～70 nm之间，可以获得对比度较佳的图像。

切片前，要将标本包埋块顶端修成近45° 角的四边锥体，使须切片的标本露出，切面呈长宽约为0.4 mmx0.6 mm的长方形或梯形。然后把标本包埋块夹在标本夹中，固定在切片机臂的远端。玻璃切片刀，需用胶布围成水槽，加入适量蒸馏水，使切下的薄片漂在水面，用铜网收集。

薄片的厚度可从薄片与水面反射光所产生的干涉色来判断：以银白色为（50～70 nm）为佳，薄片大于100 nm（紫红色）电子束的穿透较差，微细结构辨别不清，但小于40 nm（暗灰色）图像反差低，难以观察。

G. 超薄切片机的操作（示教）。

H. 染色：在平皿中放一片蜡纸，并在其上滴一滴醋酸铀染液，用弯头小镊子夹住铜网边缘，把贴有薄片的一面朝下，轻轻插入染液中，盖上平皿盖，室温下染色10～20 min，双蒸水清洗2次；置入柠檬酸铅染液中染色15 min，0.1 mol／L NaOH染液漂洗1～2 s，双蒸水清洗2次，自然干燥后观察。

其原理是利用重金属盐（如铅盐、铀盐等）与组织中某些成分结合（即醋酸铀可与大多数细胞成分结合，尤其易于与核酸、核蛋白、结缔组织纤维成分结合。

柠檬酸铅易与蛋白质、糖类结合），以提高这些组分对电子的散射能力，增强超薄切片中不同组分对电子散射的差异，使细胞的超微结构得以充分体现，形成与细胞结构相应的图像，提高图像反差，也称电子染色。

2. 锇酸（即四氧化锇，OsO4）是一种强氧化剂，需冷冻、密封和避光保存，临用前需彻底化开，以免浓度欠佳。配制和储存不当会产生锇黑，使其失效，并对皮肤和黏膜有刺激作用，操作时最好使用通风橱，并戴防护手套。

3. 玻璃切片刀：现用现做，通常一把刀切一个标本。

4. 醋酸铀染液：有微量放射性，能发荧光，需小心使用、避光保存。染色时应避免强光直射，避免玷污皮肤和实验台面。