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透射电子显微镜与超薄切片技术

相关实验:显微镜技术

最新修订时间:

简介

透射电子显微镜是一种用透过样品的电子束使其成像的高精密度的电子光学仪器。用于观察超微结构,即小于0.2 μm、光学显微镜下无法看清的“亚显微结构”。

原理

透射电子显微镜技术的基本原理是以电子束作照明源,利用电子流的波动性,经电磁场的作用改变电子前进轨迹,产生偏转、聚焦,因此当电子束透过样品经电磁透镜的作用可放大成像。


高速运动的电子流其波长远比光波波长短,所以电镜分辨率比光镜高。一般光学显微镜放大倍数在数十倍到数百倍,特殊可到数千倍。而透射电镜的放大倍数在数千倍至一百万倍之间,有些甚至可达数百万倍或数千万倍。


由阴极发射的电子经高压加速、聚光镜聚焦形成快速电子流,投射到样品上,与样品中各种原子的核外电子发生碰撞,形成电子散射。细胞质量、密度较大的部位,电子散射度强,成像较暗;质量、密度较小的部位电子散射弱,成像较亮,结果在荧光屏上形成与细胞结构相应的黑白图像。

材料与仪器

器材:


平皿,平皿盖,青霉素小瓶,注射器(2~5 ml)

滴管,医用胶布,滤纸,新单面刀片,石蜡(块或片)

新双面刀片,解剖器材,铜网,牙签,透射电子显微镜

超薄切片机、解剖镜、制刀机、冰盒、包埋模具

恒温箱、冰箱、玻璃切片刀或钻石刀


试剂:


①乙醚

②2.5% 戊二醛:取25% 戊二醛(市售戊二醛)10 ml。

加0.1mol/L二甲肿酸钠缓冲液至100 ml,装入茶色瓶中,置4 ℃冰箱保存备用。

[也可用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)配制2.5% 的戊二醛]。

③0.1 mol/L(pH 7.4)二甲砷酸钠缓冲液:


将10.7 g二甲胂酸钠置于500 ml容量瓶中,先加入约400ml水,振荡使其溶解,用HCl调pH为7.4,加入剩余蒸馏水,4℃冰箱保存。

④1% OsO4:

1)配制2% 锇酸贮存液 取1 g安瓿的四氧化锇,置清洁液中浸泡48 h,后冲洗48 h,双蒸水漂洗30 min。


干后用玻璃刀刻痕1~2道,置于棕色磨口瓶中,加入0.1 mol/L二甲砷酸钠缓冲液50 ml,用力摇动使安瓿破碎。


用蜡严密封口,放置干燥器中;静置48 h锇酸溶解;4 ℃避光保存,备用。


2)配制1% 锇酸使用液(现用现配)取2% 锇酸贮存液10 ml,加入0.2 mol/L二甲砷酸钠缓冲液(pH7.3)10 ml,混合即可。


⑤30%、50%、70% 乙醇溶液。


⑥80%、90%、95% 丙酮溶液,100% 丙酮溶液,3:1的100%丙酮溶液与包埋剂的混合液,1:1的100% 丙酮溶液与包埋剂的混合液,1:3的100% 丙酮溶液与包埋剂的混合液。


⑦环氧树脂(Epon812)包埋剂


A液:Epon812 6.2 ml
DDSA(十二烷基琥珀酸酐,软化剂) 10 ml
B液:Epon812 10 ml

MNA(甲基纳迪克酸酐,硬化剂) 8.9 ml


使用时,A液和B液按一定比例混合后,逐滴加入1.5% 的DMP-30[2,4,6-三(二甲基氨基甲基)苯酚],边加边搅拌,持续20 min左右。一般A液和B液混合比例:冬季1:9;夏季2:8。


⑧醋酸铀染液:称取醋酸双氧铀1.54 g,溶于20 ml的50% 或70% 的乙醇(pH3.8)中,充分溶解后过滤,4 ℃冰箱避光保存。


⑨柠檬酸铅染液: 称取硝酸铅1.33 g、柠檬酸钠1.76 g

置入50ml容量瓶中加双蒸水(用前沸煮5min,冷却后用)

30ml,振摇约30min,至呈现乳白色悬液

加1mol/L NaOH 8ml;加双蒸水至50ml、混匀(pH为12)。


⑩蒸馏水,双蒸水。
⑪0.1mol/L NaOH染液。

步骤

透射电镜生物标本常规超薄切片术,以家兔肝脏为例介绍制作过程及方法:


A. 取材:将活兔用乙醚轻微麻醉,迅速打开腹腔,暴露肝脏,用锋利的双面刀片切取小于1 mm3肝组织,立即投入固定液中。取材过程要求迅速,通常将动物麻醉后取材,如处死后取材,要在1~2 min内完成;其过程在低温(0~4 ℃)下进行,以防止动物死后胞因缺氧发生超微结构的变化。


B. 固定:投入到2.5% 戊二醛中的肝组织,4 ℃固定2 h;用二甲胂酸钠缓冲液(0.1 mol/L、pH7.4)洗3次,每次10 min;然后放入1% 锇酸中,4 ℃固定2 h。固定是利用化学试剂使细胞的细微结构或化学成分保持生前状态。


C. 脱水

①漂洗:将锇酸固定后的标本取出,用滤纸吸干液体,再用双蒸水漂洗3次,每次10 min。


②脱水:经漂洗后的标本,按顺序投入到30%、50%、70%的乙醇中,4 ℃下各10 min;然后在室温下,投入到80%、90%、95% 的丙酮中各10 min,2份100% 的丙酮中各1次,每次各10 min。


用脱水剂把组织细胞内的游离水去除,使包埋剂能够均匀地渗入细胞内。(如实验需中途停顿可把标本放在70% 的乙醇中过夜)。


D. 浸透:在室温或37 ℃下,将标本分别置入3:1、1:1和1:3的100% 丙酮与包埋剂混合液中,时间分别为10~30 min、30~60 min和1~2 h或过夜;再置入纯包埋剂中,2~5 h或过夜。其目的是用包埋剂置换出标本中的丙酮。


E. 包埋与聚合:取清洁干燥的包埋模具(如2号药用胶囊),先用注射器向胶囊中滴一滴包埋剂,后用牙签将标本挑入胶囊中,使标本位于液面中央,再向胶囊中缓缓注满包埋剂。


电镜生物标本常用环氧树脂作包埋剂,聚合后可切成超薄切片,并耐受电子束轰击。将包埋好的标本放入温箱中聚合,使包埋剂固化。固化过程一般在37℃处理12 h、45 ℃处理12 h、60 ℃处理24 h;也可直接放入60 ℃温箱中处理24 h。


目的是使包埋剂聚合、硬化,由流体变为均匀的固体。在切片时,其内包埋的肝组织能够保持结构不变。包埋块一般可长期保存。


F. 超薄切片:普通透射电子显微镜的加速电压多为70~100 kV。电子束常难以穿透较厚的组织切片,而医学生物材料的超薄切片在50~70 nm之间,可以获得对比度较佳的图像。


切片前,要将标本包埋块顶端修成近45° 角的四边锥体,使须切片的标本露出,切面呈长宽约为0.4 mmx0.6 mm的长方形或梯形。然后把标本包埋块夹在标本夹中,固定在切片机臂的远端。玻璃切片刀,需用胶布围成水槽,加入适量蒸馏水,使切下的薄片漂在水面,用铜网收集。


薄片的厚度可从薄片与水面反射光所产生的干涉色来判断:以银白色为(50~70 nm)为佳,薄片大于100 nm(紫红色)电子束的穿透较差,微细结构辨别不清,但小于40 nm(暗灰色)图像反差低,难以观察。


G. 超薄切片机的操作(示教)。


H. 染色:在平皿中放一片蜡纸,并在其上滴一滴醋酸铀染液,用弯头小镊子夹住铜网边缘,把贴有薄片的一面朝下,轻轻插入染液中,盖上平皿盖,室温下染色10~20 min,双蒸水清洗2次;置入柠檬酸铅染液中染色15 min,0.1 mol/L NaOH染液漂洗1~2 s,双蒸水清洗2次,自然干燥后观察。


其原理是利用重金属盐(如铅盐、铀盐等)与组织中某些成分结合(即醋酸铀可与大多数细胞成分结合,尤其易于与核酸、核蛋白、结缔组织纤维成分结合。


柠檬酸铅易与蛋白质、糖类结合),以提高这些组分对电子的散射能力,增强超薄切片中不同组分对电子散射的差异,使细胞的超微结构得以充分体现,形成与细胞结构相应的图像,提高图像反差,也称电子染色。

注意事项

1. 二甲胂酸钠缓冲液:有异味和毒性,配制和使用时要格外小心。配制应在防护罩内进行,避免试剂与皮肤直接接触,避免吸入呼吸道。


2. 锇酸(即四氧化锇,OsO4)是一种强氧化剂,需冷冻、密封和避光保存,临用前需彻底化开,以免浓度欠佳。配制和储存不当会产生锇黑,使其失效,并对皮肤和黏膜有刺激作用,操作时最好使用通风橱,并戴防护手套。


3. 玻璃切片刀:现用现做,通常一把刀切一个标本。


4. 醋酸铀染液:有微量放射性,能发荧光,需小心使用、避光保存。染色时应避免强光直射,避免玷污皮肤和实验台面。

来源:丁香实验

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