LCM显微切割

这段时间做的LCM显微切割少量组织，提取ng量级RNA的过程奉上。此类RNA可以经两轮扩增后上样进行基因芯片的研究；或直接作为模板进行RT-PCR的研究。虽然过程复杂一些，目前看效果还是不错。

标本来自新鲜的动物或人体的组织标本，取材后液氮速冻后，－80℃存放备用。

<font>标本冰冻切片的要求：</font>

1.每例标本切取覆膜切片5张，玻璃切片一张，厚度8 μm，不染色。切片过程中尽量保持冰冻低温，保持无RNA酶状态。
2.每张切片放置一张组织切片，尽量减少“粗切”。
3.用抗RNA酶液清洁所有标本可能接触的地方，包括手套、切片、切片盒。用全新的切片盒运送切片。
4.每个标本相对应的切片应该标记相应标本的标号以及切取的连续号码。所有切片剩余的组织重新放入原来的标本储存管中，－80℃存放。
5.每例标本均应用一枚新的刀片，并且用抗RNA酶液擦拭，防止 RNA的交叉污染。
6. 玻片经H&E染色保存备查，或用HE玻片来判断标本的质量，如果玻片的细胞形态完整，则认为标本质量较好，在接着切覆膜切片。

<font>冰冻切片的显微切割过程：</font>

每张覆膜冰冻切片经过H&E染色后，在Leica LMD6000显微切割系统进行肿瘤细胞和肿瘤间质的分选。

H&E染色的过程包括：

⑴将准备切割的切片从-80℃冰箱取出，室温放置30s；

⑵70%酒精5s；

⑶DEPC水10s；

⑷Gill’s #2 苏木素染液30s；

⑸DEPC水10s；

⑹Scott’s TAP 水10s；

⑺70%酒精5s；

⑻伊红3-10s；

⑼95%酒精10s；

⑽95%酒精10s；

⑾100%酒精10s；

⑿100%酒精10s；

⒀二甲苯30s；

⒁二甲苯3min；

⒂室温干燥5min。

<font>LEICA LMD6000 显微切割</font>

1.按顺序打开显微操作平台、激光发生器、软件计算机的电源。

2.打开LEICA显微切割操作软件。

3.设置软件操作参数：放大倍数为20×；线条为连续，封闭；切割精度为精确切割；切割时间为选择后切割。

4.将切片放置于载片架上，将0.5ml PCR管放置于持管架上，管盖内加入50μL细胞溶解缓冲液。

5.选定目标细胞群，点击开始切割，附有选定的目标细胞群PEM膜即会落入管盖的细胞溶解缓冲液中。

<font>RNA的抽提（ARCTURUS PICOPURE RNA 抽提试剂盒）</font>

1.将包含目标细胞群的细胞抽提缓冲液（来自LCM）经瞬间离心至管底，PCR管在42℃孵育30分钟。

2.800g离心2分钟。

3.细胞抽提缓冲液可以置于-80℃保存，或进入下一步抽提。

4.将RNA纯化离心柱加入预处理缓冲液250μL，室温放置5分钟，16000g离心1分钟。

5.在细胞缓冲液管中加入50 μL 70%酒精，枪头吹匀混合液，禁止离心。

6.将酒精和细胞缓冲液的混合液加入预处理的离心柱（100-200 μL）。

7.100g离心2分钟，接着16000g离心30秒。

8. 加100 μL洗涤缓冲液1至离心柱，8000g离心1分钟。
此时可同时进行DNase酶抑制步骤：加5 μL无RNase酶DNase酶储存溶液至35 μL RDD缓冲液，缓慢混匀；加此40 μL混匀液至离心柱，在室温放置15分钟；加40 μL洗涤缓冲液1至离心柱，8000g离心15秒。

9.加100 μL洗涤缓冲液2至离心柱，8000g离心1分钟。

10.加100 μL洗涤缓冲液至离心柱，16000g离心2分钟。检查离心柱，如有液体残留，则再次离心1分钟。

11.将离心柱转移至新的1.5ml EP管。

12.加11 μL（不超过30 μL）洗提缓冲液至离心柱的滤膜上。

13.室温下放置1分钟， 1000g离心1分钟，接着16000g离心1分钟洗提RNA。取1μL RNA溶液应用Aglient 2100 分析仪，RNA 6000 pico 芯片，检测RNA的质量。剩余RNA -80℃保存备用。

<font>应用RNA Agilent 2100 Bioanalyzer检测RNA 质量和数量</font>

Ladder准备：试剂盒内的所有试剂均升温至室温。第一次应用RNA 6000 ladder：取5 μL ladder至1.5ml EP管，加热至70℃ 2分钟，瞬间离心，冰上骤冷；加入745 μL 无RNA酶水，震荡后瞬间离心，将液体分装成10 μL每小管后于-80℃保存。
胶的准备：将550 μL的RNA6000 pico 胶基置于离心滤膜柱，1500g离心10分钟，将胶分装成65 μL每小管置于4℃保存，1个月内用完。
使用前，将RNA pico kit在室温下放置至少30分钟。

<font>步骤</font>

1.将65μL的滤过胶放置于1.5ml的EP管中。

2.震荡RNA 6000 Pico染色浓缩液10秒，吸取1μL加入胶液中。

3.震荡后，室温13000g离心10分钟。

4.取一个新的pico芯片置于芯片盒（注意：肯定芯片盒的位置于C位）。

5.吸取9μL加染色液的胶，将枪头置于芯片上标有“G”的 加样井槽底（最下面的G槽），释放胶液。

6. 将注射器的活塞拉至1ml的位置，接至芯片盒。

7. 关闭芯片盒。

8. 推进注射器活塞直至经过注射器的活塞固定栓，并保持位置。

9. 等30秒后拉动活塞固定栓，注射器活塞会缓慢回位。

10. 在等5秒后，缓慢将活塞拉回到1ml位置。

11. 打开芯片盒，翻转芯片，检查有没有气泡存在（应该没有）。

12. 在另外两个“G”槽中加入9μL胶液。

13. 吸取9μLRNA 6000 Pico 预处理缓冲液。

14. 注入标记有“CS”的小槽内。

15. 加5μL RNA 6000 Pico Marker 至所有将要加上样样品和Ladder的小槽内。

16. 加6μL RNA 6000 Pico Marker 至所有不需要加上样样品的剩下的小槽内。

17. 加1μL前面处理过的Ladder在标记有Ladder的小槽内。

18. RNA样品70℃变性2分钟，每个加样小槽内加样品RNA1μL。

19. 将芯片在专用震荡器上于IKA2400震荡标准震荡1分钟。

20. 运行Agilent2100 Bio分析软件。

21. 缓慢将RNase 电极清洗芯片注入350μLRNase Away。

22. 将RNase电极清洗芯片放置入Agilent 2100 生物分析仪内。

23. 关闭分析仪，清洗电极1分钟。

24. 缓慢将DEPC电极清洗芯片注入350μL DEPC水。

25. 将DEPC电极清洗芯片放置入Agilent 2100 生物分析仪内。

26. 关闭分析仪，清洗电极10秒钟。

27. 打开分析仪，移去DEPC电极清洗芯片，等电极上的水蒸发10秒钟。