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🔥 elisa 法

相关实验:🔥 阳性杂交瘤细胞的筛选

别名:酶联免疫吸附法

最新修订时间:

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合作专家 | 农晓静硕士

药学 上海交通大学

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审核专家 | 郭雅婕博士

生物化学分子生物 中国科学院大学

简介

ELISA 法是一种免疫测定技术,利用抗原抗体结合的手段,实现细胞或组织内生物活性物质的检测和定量。融合后的杂交瘤细胞可以产生大量相同的抗体,而细胞融合是一个随机的过程。

在已经融合的细胞中,有相当比例的无关细胞的融合体,需进行筛选和克隆化,而这种杂交瘤阳性克隆的筛选中,需对单克隆抗体进行检测,常用方法有酶联免疫吸附试验(ELISA),间接血凝试验(PHA),放射免疫测定(RIA)、直接和间接荧光抗体技术(DFA、IFA)以及免疫酶斑点试验等。

原理

首先用抗原或抗体包被于固相载体,加入待测抗体或抗原的标本,再加入酶标记抗体或抗原,生成复合物,加底物显色,生成有色产物,通过酶标仪检测吸光值,从而计算出待测物的含量。

用途

阳性杂交瘤筛选。

材料与仪器

1、试剂

包被缓冲液 CBS(0.05M 碳酸盐缓冲液,pH 9.6)、封闭液(含 2% BSA 的包被缓冲液 CBS)、PBST(含 0.05% Tween-20 的 PBS(pH 7.4))、抗体稀释液(含 1% BSA 的 PBS 缓冲液,pH 7.4)、二抗工作液(参照二抗说明书推荐稀释比配制)、TMB 底物、终止液(0.5M H2SO4

2、仪器和耗材

移液器和枪头、酶标板、酶标仪、摇床、1.5/2 mL 离心管、15 ml 离心管、灭菌加样槽、滤纸

步骤

使用 ELISA 筛选阳性杂交瘤细胞株的步骤如下:

1、抗原用包被缓冲液 CBS 按 1 μg/mL 浓度用作连续 1:2 梯度稀释,每个稀释度包被一行(12 孔/行),100 μl/孔加入酶标板中,覆膜密封(防止水分挥发),4 ℃ 包被过夜(12 h 以上)。

2、弃去板中液体,在滤纸上拍干,每孔加入 150 μL 封闭液,室温(25 ℃)封闭 2 h 以上。

3、用洗涤液 PBST 洗板 3 次,将待测高免阳性血清和空白阴性血清用抗体稀释液分别从 1:500 开始做连续 1:2 倍比稀释,按下图分布模式加入酶标板,每孔 100 μl,37 ℃ 孵育 1 h。

4、弃去板中液体,在滤纸上拍干,洗涤液洗板 3 次,每孔加入 100 μl 二抗工作液,37 ℃ 摇床上低速孵育 1 h。

5、弃去板中液体,在滤纸上拍干,洗涤液洗板 3 次,每次 2 分钟,每孔加入 100 μl 单组份 TMB 底物,室温摇床上低速孵育 5~20 min(孵育时间取决于颜色变化速度)。

6、每孔加入 50 μl 终止液(0.5M H2SO4)。

7、在酶标仪上读取 450 nm/630 nm 的吸光度。

标准的结果分布模式如上图所示: ELISA 酶标板显色由阴阳性区域第一行第一列孔向外显均匀放射状递减;如果在包被梯度方向上 OD450 过高无梯度,应该继续降低包被浓度;反之,则增加。同理,如果在免疫血清稀释度方向上 OD450 过高无梯度,则应继续加大稀释度,反之,则减小。

8、最佳包被浓度的确定:

阳性血清区域内某个孔对应的 OD 值与其上/其左孔 OD 值恰好为 2 倍关系且 OD 值不低于 1.2,且此孔对应的阴性血清区域 OD 值与空白对照孔 OD 值无差异,此孔包被的抗原浓度的 2 倍确定为抗原的最佳包被浓度。同理也可以参照此方法确定阳性血清的最佳稀释倍数。

9、以最佳包被浓度将抗原按照上述方法包被到酶标板同时封闭,将阴性/阳性血清依次倍比稀释,100 μl 加到酶标板孔(最好做复孔),然后依次加入二抗、底物显色,读取 OD 值。

10、阳性细胞株/阳性孔的筛选:

选取阳性值最高的孔予以保留并进行亚克隆,具体该选择保留多少孔根据项目实际需求决定。

注意事项

1、阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后 10 天作第一次检测,过早容易出现假阳性。

2、阳性克隆的筛选应进行多次,均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。筛选方法必须在融合前建立,避免由于方法不当贻误整个筛选时机。

3、一般在杂交瘤细胞布满孔底 1/10 面积时,即可开始检测特异性抗体,筛选出所需要的杂交瘤细胞系。

常见问题

1、杂交瘤细胞融合后得不到阳性克隆

可能的原因如下:

(1)动物未免疫成功就进行了融合。

(2)融合后得到的克隆较少,故得到阳性克隆的机率也较小。

(3)筛选克隆手段不正确。例如有些小分子物质不可以直接包被到酶标板上,再如使用了不适当的二抗等诸多因素。

(4)抗原成份与细胞培养条件中的物质相同或类似,或者与筛选过程中有同抗原结构相同或类似的物质产生了竞争反应。

(5)其它所有能影响 ELISA 等相关筛选手段的因素。

2、阳性克隆转为阴性

正常情况下,杂交瘤不是绝对稳定的,容易发生染色体丢失的情况,尤其是当细胞移到新环境中生长,如从小孔扩大到大孔,或者复苏操作时,更容易发生阳性变为阴性。可通过以下办法尽量减少阳性变为阴性:

(1)保证细胞处在最佳的生长环境中,适时更换培养基。

(2)不要过于频繁操作细胞,否则细胞容易出现死亡或者生长形态发生明显变化。

(3)对于传代次数较多的细胞株需要经常进行亚克隆,并将每一次的亚克隆株冻存保种。

(4)防止细胞被支原体等微生物污染。

来源:丁香实验

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