🔥 elisa 法

ELISA 法是一种免疫测定技术，利用抗原抗体结合的手段，实现细胞或组织内生物活性物质的检测和定量。融合后的杂交瘤细胞可以产生大量相同的抗体，而细胞融合是一个随机的过程。

在已经融合的细胞中，有相当比例的无关细胞的融合体，需进行筛选和克隆化，而这种杂交瘤阳性克隆的筛选中，需对单克隆抗体进行检测，常用方法有酶联免疫吸附试验（ELISA），间接血凝试验（PHA），放射免疫测定（RIA）、直接和间接荧光抗体技术（DFA、IFA）以及免疫酶斑点试验等。

首先用抗原或抗体包被于固相载体，加入待测抗体或抗原的标本，再加入酶标记抗体或抗原，生成复合物，加底物显色，生成有色产物，通过酶标仪检测吸光值，从而计算出待测物的含量。

阳性杂交瘤筛选。

1、试剂

包被缓冲液 CBS（0.05M 碳酸盐缓冲液，pH 9.6）、封闭液（含 2% BSA 的包被缓冲液 CBS）、PBST（含 0.05% Tween-20 的 PBS（pH 7.4））、抗体稀释液（含 1% BSA 的 PBS 缓冲液，pH 7.4）、二抗工作液（参照二抗说明书推荐稀释比配制）、TMB 底物、终止液（0.5M H₂SO₄）

2、仪器和耗材

移液器和枪头、酶标板、酶标仪、摇床、1.5/2 mL 离心管、15 ml 离心管、灭菌加样槽、滤纸

使用 ELISA 筛选阳性杂交瘤细胞株的步骤如下：

1、抗原用包被缓冲液 CBS 按 1 μg/mL 浓度用作连续 1:2 梯度稀释，每个稀释度包被一行（12 孔/行）,100 μl/孔加入酶标板中，覆膜密封（防止水分挥发），4 ℃ 包被过夜（12 h 以上）。

2、弃去板中液体，在滤纸上拍干，每孔加入 150 μL 封闭液，室温（25 ℃）封闭 2 h 以上。

3、用洗涤液 PBST 洗板 3 次，将待测高免阳性血清和空白阴性血清用抗体稀释液分别从 1:500 开始做连续 1:2 倍比稀释，按下图分布模式加入酶标板，每孔 100 μl，37 ℃ 孵育 1 h。

4、弃去板中液体，在滤纸上拍干，洗涤液洗板 3 次，每孔加入 100 μl 二抗工作液，37 ℃ 摇床上低速孵育 1 h。

5、弃去板中液体，在滤纸上拍干，洗涤液洗板 3 次，每次 2 分钟，每孔加入 100 μl 单组份 TMB 底物，室温摇床上低速孵育 5～20 min（孵育时间取决于颜色变化速度）。

6、每孔加入 50 μl 终止液（0.5M H₂SO₄）。

7、在酶标仪上读取 450 nm/630 nm 的吸光度。

标准的结果分布模式如上图所示： ELISA 酶标板显色由阴阳性区域第一行第一列孔向外显均匀放射状递减；如果在包被梯度方向上 OD450 过高无梯度，应该继续降低包被浓度；反之，则增加。同理，如果在免疫血清稀释度方向上 OD450 过高无梯度，则应继续加大稀释度，反之，则减小。

8、最佳包被浓度的确定：

阳性血清区域内某个孔对应的 OD 值与其上/其左孔 OD 值恰好为 2 倍关系且 OD 值不低于 1.2，且此孔对应的阴性血清区域 OD 值与空白对照孔 OD 值无差异，此孔包被的抗原浓度的 2 倍确定为抗原的最佳包被浓度。同理也可以参照此方法确定阳性血清的最佳稀释倍数。

9、以最佳包被浓度将抗原按照上述方法包被到酶标板同时封闭，将阴性/阳性血清依次倍比稀释，100 μl 加到酶标板孔（最好做复孔），然后依次加入二抗、底物显色，读取 OD 值。

10、阳性细胞株/阳性孔的筛选：

选取阳性值最高的孔予以保留并进行亚克隆，具体该选择保留多少孔根据项目实际需求决定。

1、阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后 10 天作第一次检测，过早容易出现假阳性。

2、阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。

3、一般在杂交瘤细胞布满孔底 1/10 面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。

1、杂交瘤细胞融合后得不到阳性克隆

可能的原因如下：

（1）动物未免疫成功就进行了融合。

（2）融合后得到的克隆较少，故得到阳性克隆的机率也较小。

（3）筛选克隆手段不正确。例如有些小分子物质不可以直接包被到酶标板上，再如使用了不适当的二抗等诸多因素。

（4）抗原成份与细胞培养条件中的物质相同或类似，或者与筛选过程中有同抗原结构相同或类似的物质产生了竞争反应。

（5）其它所有能影响 ELISA 等相关筛选手段的因素。

2、阳性克隆转为阴性

正常情况下，杂交瘤不是绝对稳定的，容易发生染色体丢失的情况，尤其是当细胞移到新环境中生长，如从小孔扩大到大孔，或者复苏操作时，更容易发生阳性变为阴性。可通过以下办法尽量减少阳性变为阴性：

（1）保证细胞处在最佳的生长环境中，适时更换培养基。

（2）不要过于频繁操作细胞，否则细胞容易出现死亡或者生长形态发生明显变化。

（3）对于传代次数较多的细胞株需要经常进行亚克隆，并将每一次的亚克隆株冻存保种。

（4）防止细胞被支原体等微生物污染。