合作专家 | 杨子怡硕士
药学 复旦大学
审核专家 | 聂壹峰博士
纳米生物医学 中国科学院大学
简介
免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是以免疫学的抗原-抗体反应为理论基础，使用标记的特异性抗体，在细胞组织中检测和定位抗原（例如蛋白质）的技术。这种方法利用了抗体与抗原之间的特异性结合。在阳性杂交瘤的筛选中，IHC 可以用来确定杂交瘤细胞是否产生了目标抗体。
原理
1、抗体和抗原的特异性结合：抗体是由免疫系统产生的，用来识别和结合特定抗原（通常是外来物质，如病毒或细菌，但也可以是自身的蛋白质）的蛋白质。每种抗体都能特异性地识别并结合到其对应的抗原。IHC 利用了这种特异性结合，通过使用特定的抗体来检测和定位特定的抗原。
2、抗体的标记和检测：为了在组织切片中可视化抗原，抗体通常会被标记，例如与荧光分子或酶（如过氧化物酶）结合。当这些标记的抗体结合到其目标抗原时，它们可以通过特定的检测方法（如荧光显微镜、电子显微镜或酶底物反应等）被可视化。
3、抗原的定位：通过观察标记抗体的位置，可以确定抗原在组织或细胞中的位置。
在阳性杂交瘤的筛选中，IHC 可以用来确定杂交瘤细胞是否产生了目标抗体。使用一个针对特定抗体的抗原进行 IHC，如果杂交瘤细胞产生了目标抗体，应该能在 IHC 中看到信号。
用途
1、疾病诊断：IHC 是病理学诊断的重要工具，特别是在肿瘤诊断中。通过检测特定的蛋白质标记物，可以帮助确定肿瘤的类型和起源。例如，某些类型的乳腺癌细胞会过度表达 HER2 蛋白，这可以通过 IHC 来检测。
2、研究蛋白质表达和定位：IHC 可以用来研究特定蛋白质在组织或细胞中的表达和定位，这对于理解蛋白质的功能和疾病的机制非常有用。
3、药物研发：在新药研发过程中，IHC 可以用来评估药物对蛋白质表达的影响，或者用来检测药物的分布和靶向效果。
4、杂交瘤筛选：在抗体生产中，IHC 可以用来筛选和验证阳性杂交瘤细胞，这些细胞能够产生目标抗体。
5、疾病机制研究：IHC 可以用来研究疾病的发生和发展机制，例如，通过检测炎症、纤维化或其他病理过程中的特定蛋白质。
材料与仪器
1、组织样本：动物或人类的组织，通常需要进行固定和包埋（通常是石蜡包埋）以便切片。
2、切片设备：用于将组织样本切成薄片，通常是微切（片）机。
3、抗原修复溶液：用于恢复在固定和包埋过程中可能被破坏的抗原。
4、阻断溶液：用于防止非特异性抗体结合。
5、特异性抗体：一抗是特异性结合到目标抗原的抗体，二抗是结合到一抗的抗体，并且通常带有一个可以检测的标记以便观测，如荧光分子或酶。
6、检测系统：一个荧光显微镜（对于荧光标记的抗体），或者一个酶底物系统（对于酶标记的抗体）。
7、染色剂和封片剂：用于增强对比度和保护切片。
8、显微镜：用于观察和分析结果。
步骤
1、 组织制备：首先，需要获取组织样本并将其固定，通常是使用 10% 甲醛。然后将固定的组织样本进行脱水、透明、浸蜡，最后在微切机上切成薄片。
2、脱蜡和水化：将切片放入二甲苯或丙酮中进行脱蜡，然后通过酒精系列梯度进行水化。
3、抗原修复：抗原修复是为了恢复在固定和包埋过程中可能被破坏的抗原。这通常涉及到在酸性或碱性环境中加热切片。
4、阻断：为了防止非特异性抗体结合，切片需要进行阻断处理。这通常是通过将切片浸入含有蛋白质（如牛血清白蛋白）或其他阻断剂的溶液中完成的。
5、一抗孵育：切片被浸入含有特异性抗体（一抗）的溶液中，这些抗体会结合到目标抗原。孵育的时间和温度可能会根据抗体的具体要求而变化。
6、洗涤：使用缓冲液（如 PBS 或 TBS）洗涤切片，以去除未结合的一抗。
7、二抗孵育：切片浸入含有二抗的溶液中。二抗是结合到一抗的抗体，并且通常带有一个可以检测的标记，如荧光分子或酶。
8、洗涤：再次使用缓冲液洗涤切片，以去除未结合的二抗。
9、检测：如果二抗带有荧光标记，那么可以直接在荧光显微镜下观察。如果二抗带有酶标记（如过氧化物酶），那么需要添加相应的底物，通常会在酶的作用下产生可见的沉淀。
10、对照染色和封片：最后可以使用染色剂（如苏木精-伊红）对细胞核进行染色，以增强对比度。然后使用封片液封住。
注意事项
1、组织制备：固定和包埋的过程需要仔细操作，以保持组织的结构和抗原的完整性。固定的时间和方法，以及包埋的材料，都可能影响到抗原的可检测性。
2、抗原修复：抗原修复的方法（如热诱导的抗原修复或酶诱导的抗原修复）和条件（如时间和温度）需要根据抗体的特性和组织类型进行优化。过度的抗原修复可能会破坏抗原结构，而不足的抗原修复也可能会导致抗原被掩盖，无法被抗体识别。
3、阻断：阻断的目的是防止非特异性的抗体结合，需要选择适当的阻断剂。常用的阻断剂包括牛血清白蛋白（BSA）和正常羊血清。阻断的时间和条件也需要优化。
4、抗体孵育：抗体的稀释和孵育条件需要进行优化，以确保最佳的信号和最小的背景。抗体的稀释通常需要根据抗体的特性和目标抗原的丰度进行试验确定。孵育的时间和温度也可能需要优化。
5、洗涤：充分的洗涤步骤可以帮助去除未结合的抗体，减少背景信号。洗涤的次数和时间，以及洗涤液的选择（如 PBS 或 TBS），都可能影响到结果。
6、检测和显像：检测和显像步骤需要根据抗体的标记和预期的信号强度进行优化。例如，如果使用荧光标记的抗体，需要选择适当的荧光滤光片和曝光时间。如果使用酶标记的抗体，需要选择适当的底物和调试显色时间。
7、对照：应该包括适当的阳性和阴性对照，以验证实验的特异性和敏感性。阳性对照是已知含有目标抗原的样本，阴性对照是已知不含目标抗原的样本，或者是省略一抗的样本。
8. 结果解释：结果的解释需要考虑到实验的限制，以及其他可能影响结果的因素，如组织的处理和切片的质量。对于定量或半定量的分析，可能需要进行适当的统计分析。
常见问题
1、背景过高：这可能是由于非特异性的抗体结合，或者检测步骤过敏感。可能的解决方案包括优化阻断步骤，调整抗体的稀释，或者减少检测步骤的敏感性。
2、信号过弱或无信号：这可能是由于抗原的丰度过低，或者抗体的质量或稀释不适当。可能的解决方案包括优化抗原修复步骤，使用更高质量的抗体，或者增加抗体的浓度。
3、信号不均匀：这可能是由于切片的处理不均匀，或者抗体的孵育不均匀。可能的解决方案包括改进切片的处理和存储条件，或者确保抗体在孵育过程中能够均匀覆盖切片。
4、结果不可重复：这可能是由于实验条件的变化，或者抗体的质量不一致。可能的解决方案包括标准化实验条件，或者从可靠的供应商购买抗体。
5、结果解释困难：这可能是由于背景信号的干扰，或者目标抗原在组织中的分布不清楚。可能的解决方案包括使用更特异性的抗体，或者结合其他技术（如基因表达分析）来验证结果。
来源：丁香实验
