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🔥 利用流式筛选阳性杂交瘤细胞

相关实验:🔥 阳性杂交瘤细胞的筛选

最新修订时间:

丁香实验推荐阅读

合作专家 | 黄婕硕士

生物学 中国科学技术大学

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审核专家 | 陈慕华博士

肿瘤学 北京大学

简介

流式细胞仪基于对荧光标记抗原与抗体亚型结合免疫球蛋白作为筛选指标,能够全自动、快速、高效地对针对抗原特异性且活的杂交瘤细胞进行筛选。

原理

通过测量单个细胞经适当染色后所发出的散射光和荧光,并将它们定量转化成电信号,经数字转换器进行数字化后进行电子存储后进行分析。

用途

测量细胞的大小、内部颗粒的性状,检测细胞表面和胞浆抗原、细胞内 DNA、RNA 含量等。

材料与仪器

仪器:

① 电泳仪

② 96 孔板

③ 细胞电融仪器

④ 流式细胞仪


试剂:

① BALB/c 小鼠

② 小鼠骨髓瘤细胞株 SP2/0

③ 费氏不完全佐剂

④ 费氏完全佐剂

⑤ HAT 培养基添加剂

⑥ 胰蛋白酶溶液和胎牛血清

⑦ CD CHO Medium 培养基

⑧ 融合蛋白纯化所用的镍琼脂糖凝胶

⑨ 单克隆抗体检测试剂盒

步骤

1、目标蛋白-His 融合蛋白的表达与纯化


构建目标蛋白与 His 标签融合蛋白表达载体,并将其转入 CHO 细胞,验证目标蛋白表达并筛选稳定分泌目标蛋白的细胞系。用含 10% FBS 的 CD CHO Medium 培养基悬浮培养 CHO-目标蛋白细胞。当细胞密度培养至 1×107/mL 时,将细胞悬液离心获取细胞上清。利用目的蛋白携带的 His 标签,采用镍琼脂糖凝胶色谱分离蛋白的方法纯化融合蛋白。

 

2、融合蛋白的 WB 检测


将纯化的融合蛋白与对照蛋白制备样本后进行 SDS‐PAGE 电泳和电转,封闭后 4 °C 过夜孵育抗体。0.05% PBST 洗膜后孵育二抗,再次洗膜后利用 ECL 进行显色。

 

3、杂交瘤细胞株的构建与培养


将融合蛋白与佐剂乳化后注入小鼠腋窝、背侧部皮下免疫小鼠,使其 B 淋巴细胞经抗原提呈作用产生针对目标蛋白的特异免疫反应。免疫分多次进行,首次的蛋白剂量为 40 μg,将融合蛋白溶于 250 μL 生理盐水并与等体积弗氏完全佐剂乳化。28 d 后进行二次免疫,蛋白剂量为 20 μg,并用弗氏不完全佐剂乳化。


二次免疫 7 d 后,取小鼠眼眶血,保留血清成分。在电融合前 4 d 进行加强免疫,蛋白剂量为 40 μg。利用电融合方法将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞 SP2/0 融合,形成杂交瘤细胞。利用 HAT 培养基筛选融合的杂交瘤细胞。采用间接 ELISA 筛选识别目标蛋白重组蛋白的抗体,利用有限稀释法克隆杂交瘤细胞株。

 

4、单克隆抗体检测


利用 ELISA 原理检测抗体亚型。将融合蛋白包被于酶标微孔板,过夜后洗板。将杂交瘤细胞上清与板中融合蛋白孵育 2 h,洗板后利用试剂盒显色。

 

5、流式鉴定


为了鉴定杂交瘤细胞上清中含有的流式抗体,将融合后的杂交瘤细胞培养于 96 孔板,根据细胞生长情况传代培养至 6 孔板后收取培养的细胞上清,利用流式细胞术检测杂交瘤细胞上清是否含有识别目标蛋白的抗体。用胰酶消化培养的融合细胞并制备成细胞悬液,以 5×105 的细胞数量与 200 μL 杂交瘤细胞上清冰上孵育 1 h,PBS 洗涤 3 次。将 APC 偶联的抗小鼠 IgG 荧光二抗用 PBS 以 1:100 稀释 ,取 100 μL 与融合蛋白细胞孵育 20 min。PBS 洗涤 3 次,用 300 μL PBS 重悬细胞,上机检测。

注意事项

1、一定记得对照管的设置(空白、单阳、同型、FMO 管、阴/阳管)。
2、学会圈门以及调节补偿。

常见问题

流式原理与操作详细介绍附件:http://lifetech.ustc.edu.cn/files/detail-377.html

来源:丁香实验

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