重组子的转化和阳性克隆的筛选

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DNA连接与转化

一. 概念

1.transformation

特指以质粒DNA或以它作为载体构建的重组 子导入细菌的过程。

2.transfection

指噬菌体、病毒或以它们作为载体构建的重组 子导入细胞的过程。

3.感受态与致敏过程

细菌 处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。

二.转化方法

1.化学转化法

细菌处于0 ℃，在CaCl2低渗溶液(0.1M)中，菌体细胞膨胀成球形，DNA则与CaCl2形成抗Dnase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42 ℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，重组 子的基因在被转化的细菌中得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。

2.电转化法

取对数生长期细胞，制备一定浓度的细胞悬液(在低离子浓度状态以10%甘油制备)，4℃条件下，以高压脉冲电击细胞，使细胞摄取外源DNA，电转化法不需制备感受态细菌 ，操作简便，适用于各种菌株的转化，其转化率可达109-1010，转化率受电场强度、电脉冲时间长度及DNA的浓度影响。该法缺点是转化细胞受电场作用后活性受到一定影响。

3.感受态细胞及特点

受体细胞处于感受态是转化成功与否的关键之一。感受态是指细胞处于最适于摄取和容忍外来DNA的生理状态。感受态细胞特点为：

(1)细胞表面暴露出一些可接受外来DNA的位点(以溶菌酶处理，可促使受体细胞的接受位点充分暴露)。

(2)细胞膜通透性增加(用钙离子处理，可使膜通透性增加，使DNA直接穿过质膜进入细胞)。

(3)受体细胞的修饰酶活性最高，而限制酶活性最低，使转入的DNA分子不易被切除或破坏。

(4)受体细胞本身处于非生长繁殖阶段(即受体细胞染色体相对稳定)。

(5)不存在载体的筛选基因，多采用限制酶阴性、修饰酶阳性的大肠杆菌作为受体细胞。

三.筛选

在转化过程中，并非每个宿主细胞都被转化，即使获得转化的细胞，也并非都含目的基因，可能含有自身形成环状的在体分子，一个载体与两个外源DNA形成的重组子，或插入的非目的基因与载体形成的重组子等。因此转化后须在不同层次、不同水平上进行筛选，以区别转化子与非转化子、重组子与非重组子，以及鉴定所需的特异性重组子。

(一)根据重组子的遗传学特性筛选(平板筛选)

1.抗生素平板筛选

克隆载体具有抗生素抗性基因，如：Amp、Ter、Kan等。外源基因插在抗性

基因之外，这个重组子转化入宿主后，宿主就具有了抗生素抗性，因而在含抗生素的培养基中，只有阳性重组子才能生长。但有些单酶切的情况下，连接时有可能出现反向连接或自身环化，所以还需要进行酶切鉴定。

2.插入失活

pBR322含有Tetr及Ampr，插入Tet后变成Tets及Ampr。

3.插入表达

如质粒pTR262带有负调控Tetr基因的cI基因，cI基因表达产物可抑制Tetr表达。当目的基因插入cI基因后，使后者失活，Tetr表达，因此重组子在含有Tet的平板上可生长，自身环化的载体转化细胞则不能生长。

4.营养素依赖表型

把亮氨酸自养型载体转入亮氨酸异养型菌株即可在无亮氨酸的培养基中生长。

5.蓝白筛选

蓝白筛选是通过插入失活lacZ基因，破坏重组子与宿主之间的ɑ-互补作用来鉴别重组子与非重组子的筛选方法，是携带lacZ基因的许多载体的筛选优势。这些载体包括M13噬菌体，pUC质粒系列，pEGM质粒系列等。它们的共同特点是载体上携带一段细菌lacZ基因的α肽编码序列，其编码产物为β-半乳糖苷酶的α肽。当无外源DNA插入时，质粒表达α肽。突变型Lac-E.Coli可表达该酶的ω肽。单独存在的α及ω肽均无β-半乳糖苷酶活性，只有宿主细胞与克隆载体同时共表达这两个肽时，宿主细胞内才有β-半乳糖苷酶活性，在含有底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚- β-D-半乳糖苷)的诱导剂IPTG(异丙基硫代- β-D-半乳糖苷)条件下，菌落呈蓝色，这就是α-互补。如果LacZ基因由于插入外源基因而失活，结果无α肽表达，转化菌落无α-互补，缺乏β-半乳糖苷酶活性，在含有X-gal培养板上为白色菌落，而载体自身环化后转化的细菌为蓝色菌落。由于这种颜色标志，重组子与非重组子的区别一目了然，可以很容易将之区分。

(二)限制酶图谱筛选(电泳筛选)

(三)核酸杂交筛选

(四)免疫化学筛选

四.操作步骤

1.将大肠杆菌DH5α 在LB平板上划线，37 ℃培养16-20hr(或过夜)

2.从平板上挑取一个2-3mm大小的单菌落移至2-5ml LB液体培养基中，37 ℃强烈振荡过夜

3.取一三角瓶将菌液按1：100稀释接种，37 ℃强烈振荡培养3hr，此时细菌OD=0.2-0.4,为对数生长期或对数生长期前期

4. 将培养物置冰上10min后转移置离心管中,4000rpm,4 ℃离心5min

5. 弃上清,加入10ml(50ml原培养物)冰浴冷的0.1M CaCl2溶液,致敏悬浮细胞,置于冰上10min

6. 4000rpm, 4℃离心5min回收细胞,弃上清,每50ml原培养物再加入2ml冰冷的0.1M CaCl2溶液,悬浮细胞

7. 按每份200ul分装细胞,若不24小时内进行转化,可在感受态细胞中加入终浓度为10%的灭菌甘油,置于-70 ℃冰箱保存

8. 加10ul含40ng的DNA溶液至200ul感受态细胞中,温和混匀,置于冰上30min

9. 42 ℃热冲击90S,迅速放回冰上,将细胞冷却1-2min,加入800ulLB培养基, 37 ℃,225rpm振荡培养45-90min,让细菌中的质粒表达抗生素抗性蛋白

10. 取200ul转化混合物铺于LB+Amp(含有诱导物IPTG及生色底物X-gal)平板上,室温放置至液体被琼脂全部吸收,倒置平板于37℃培养12-16 小时(过夜).