DNA转化及重组子的筛选

互联网2013-08-27

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实验目的

了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义;

学习外源DNA转化入受体菌细胞并筛选转化子的方法。

实验原理

转化(transformation)是将异源DNA分子导入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。其原理是细菌处于0℃， CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。

转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。进入细胞的DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

将经转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转化体(transformant)，即带有异源DNA分子的受体细胞。

基因导入方法:

1)电击法 (Gene transfer by electroporation)

基因导入方法:

2)基因枪法(Biolistic-bombardment)(植物细胞)

Transfer of T-DNA from Agrobacterium into a plant cell

Regeneration of leaf disks infected by Agrobacterium

DNA重组

外源基因插入与否可通过载体上的Lac Z基因进行初步的筛选。有外源基因插入的细菌呈白斑，无外源基因插入的细菌呈蓝斑。

Alfa互补

实验仪器、材料与试剂

(一)仪器

1. 恒温摇床

2. 超净工作台

3. 恒温水浴锅

4. 恒温箱

5. 微量取液器

(二)材料

1. 实验四所得连接产物

2. 实验五制备的大肠杆菌感受态细胞

(三)试剂

1. LB固体培养基

2. 氨苄青霉素(Amp) 100mg/ml

实验步骤

转化:

1.取适量连接产物加到分装的200 μL感受态细胞中，冰上混匀，冰浴30min;此过程中，需倒含氨苄的LB平板。

2.42℃热激90s，迅速在冰浴中冷3-5min;

3.上述管中加入600μL LB培养基，于37℃振荡培养45min;此过程中，在LB平板上涂布X-Gal 40 μL和IPTG 20 μL 。

4.取适量菌液涂布LB平板(含Amp 50μg/ml)，室温涂布均匀后(至菌液完全被吸干)，于37℃倒置，过夜培养;

5.观察菌落，筛选阳性克隆。

实验结果与讨论

经抗生素初筛长出的细菌常出现假阳性的现象，为确定外源基因已转化入细菌，需另外的酶切和PCR验证。