DNA转化及重组子的筛选
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实验目的
了解细胞转化的概念及其在分子 生物学研究中的意义;
学习外源DNA转化 入受体菌细胞并筛选转化子的方法。
实验原理
转化(transformation)是将异源DNA分子导入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。其原理是细菌 处于0℃， CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。进入细胞的DNA分子 通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转化体(transformant)，即带有异源DNA分子 的受体细胞。
基因导入方法:
1)电击法 (Gene transfer by electroporation)
<center> <img alt="DNA转化及重组子的筛选" height="1521" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/08/27/A1377590284.jpg" width="600" /></center>基因导入方法:
2)基因枪法(Biolistic-bombardment)(植物细胞)
<center> <img alt="DNA转化及重组子的筛选" height="663" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/08/27/A1377590291.jpg" width="600" /></center>Transfer of T-DNA from Agrobacterium into a plant cell
<center> <img alt="DNA转化及重组子的筛选" height="1605" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/08/27/A1377590288.jpg" width="600" /></center>Regeneration of leaf disks infected by Agrobacterium
<center> <img alt="DNA转化及重组子的筛选" height="1571" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/08/27/A1377590290.jpg" width="600" /></center>DNA重组
<center> <img alt="DNA转化及重组子的筛选" height="385" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/08/27/A1377590286.jpg" width="600" /></center>外源基因插入与否可通过载体上的Lac Z基因进行初步的筛选。有外源基因插入的细菌呈白斑，无外源基因插入的细菌呈蓝斑。
Alfa互补
<center> <img alt="DNA转化及重组子的筛选" height="384" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/08/27/A1377590283.jpg" width="600" /></center>实验仪器、材料与试剂
(一)仪器
1. 恒温摇床
2. 超净工作台
3. 恒温水浴锅
4. 恒温箱
5. 微量取液器
(二)材料
1. 实验四所得连接产物
2. 实验五制备的大肠杆菌感受态细胞
(三)试剂
1. LB固体培养基
2. 氨苄青霉素(Amp) 100mg/ml
实验步骤
转化:
1.取适量连接产物加到分装的200 μL感受态细胞中，冰上混匀，冰浴30min;此过程中，需倒含氨苄的LB平板。
2.42℃热激90s，迅速在冰浴中冷3-5min;
3.上述管中加入600μL LB培养基，于37℃振荡培养45min;此过程中，在LB平板上涂布X-Gal 40 μL和IPTG 20 μL 。
4.取适量菌液涂布LB平板(含Amp 50μg/ml)，室温涂布均匀后(至菌液完全被吸干)，于37℃倒置，过夜培养;
5.观察菌落，筛选阳性克隆。
实验结果与讨论
经抗生素初筛长出的细菌常出现假阳性的现象，为确定外源基因已转化入细菌，需另外的酶切和PCR验证。
<center> <img alt="DNA转化及重组子的筛选" height="385" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/08/27/A1377590285.jpg" width="581" /></center> <center> <img alt="DNA转化及重组子的筛选" height="675" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/08/27/A1377590289.jpg" width="459" /></center> <center> <img alt="DNA转化及重组子的筛选" height="268" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/08/27/A1377590287.jpg" width="500" /></center>
