🔥 重组质粒的连接、转化及筛选

用特定的限制性内切酶切割载体 DNA 和外源 DNA 片段并进行纯化，于体外使两者相连接（若用 T-载体，可直接用纯化的 PCR 产物进行连接），转化宿主细菌后，由于载体上带有 Amp 或者 Kan 和 lacZ 基因，因此可以通过抗生素抗性筛选与蓝白斑筛选原理对重组子进行挑选。

初步的抗性筛选：载体上带有 Amp 或者 Kan 基因，而外源片段上没有，故转化受体菌后，只有带有载体 DNA 的转化子才能在含有抗生素的 LB 平板上存活下来，而带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活。

蓝白斑筛选：载体上带有 β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和 β-半乳糖苷酶 N 端 146 个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点，但并没有破坏 lacZ 的阅读框架，不影响其正常功能。E.coli DH5α、Top 10或 JM 系列菌株带有 β-半乳糖苷酶 C 端部分序列的编码信息。

在各自独立的情况下，载体和菌株编码的 β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在载体和菌株融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的 β-半乳糖苷酶突变体之间实现互补的现象叫 α-互补。

由 α-互补产生的 Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物 X-gal（5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）存在下被 IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到载体的多克隆位点后会导致读码框改变，表达蛋白失活，产生的氨基酸片段失去 α-互补能力，因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。

1. 材料

外源 DNA 片段、连接反应缓冲液

T4 DNA 连接酶、X-gal 储液、IPTG 储液

抗生素、恒温摇床、台式高速离心机

恒温水浴锅、电泳装置、电热恒温培养箱

电泳仪、移液枪、eppendorf 管

2. 试剂配制

（1）X-gal 贮液（20 mg/mL）：直接购买溶液，或用二甲基甲酰胺溶解 X-gal 固体配制成 20 mg/mL 的贮液，包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏，贮存于 -20 ℃。

（2）IPTG 贮液（200 mg/mL）：在 800 μL 蒸馏水中溶解 200 mg IPTG 后，用蒸馏水定容至 1 mL，用 0.22 μm 滤膜过滤除菌，分装于离心管并贮于 -20 ℃。

（3）含 X-gal 和 IPTG 的筛选培养基：在涂布转化子之前，于事先制备好的含抗生素的 LB 平板表面加 40 mL X-gal 贮液和 4 μL IPTG 贮液，用无菌玻璃涂布器将溶液涂匀，置于 37 ℃ 下放置 3~4 h，使培养基表面的液体完全被吸收。

一、连接反应

将约 10 ng 的载体 DNA 转移到无菌微量离心管中，加入至少 4 倍摩尔量的外源 DNA 片段，然后加入 10×T4 DNA 连接酶缓冲液（ligase buffer）1 μL，T4 DNA 连接酶 0.5~1 μL，加无菌超纯水至 10 μL 体积，充分混匀后用微量离心机将液体全部收集至管底，于 16 ℃ 保温过夜。

二、E.coli DH5α 感受态细胞的转化

1. 从 -70 ℃ 冰箱中取 100~200 μL（效率高时只需 50 μL）感受态细胞悬液，置冰上解冻。

2. 待感受态解冻后加入连接产物溶液，轻弹混匀，冰上放置 30 min。

3. 42 ℃ 水浴中孵育 90 s，并迅速置冰上冷却 3~5 min。

4. 向管中加入 lmL LB 液体培养基（不含抗生素），混匀后 37 ℃ 振荡培养 1 h，使细菌恢复生长，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。

5. 将上述菌液摇匀后取 100 μL（如感受态效率低或连接效率低则可将 l mL 菌液在 4500 rpm 低转速离心机中收集全部菌体，并重悬于 100 μL LB 培养液中）涂布于含抗生素的筛选平板上，正面向上放置 30 min，待菌液完全被培养基吸收后，将培养皿倒置于 37 ℃ 培养 16~24 h。

6. 同时做三个对照。

对照 1：以等体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液，涂板时只取 5 μL 菌液涂布于不含抗生素的 LB 平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。

对照 2：以等体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液，涂板时只取 5 μL 菌液涂布于含有抗生素的 LB 平板上。此组正常情况下应没有菌落出现。

对照 3：取一定量已知浓度的对照质粒 DNA（为本实验中的连接载体质粒），加入等量感受态细胞中，其他操作与加入连接体系的相同。此对照在正常情况下应在含抗生素的 LB 平板上出现较大量的菌落。

三、重组质粒的筛选与鉴定

1. 带有 T-vector 的空载体的转化子由于具有 β-半乳糖苷酶活性，在 X-gal 和 IPTG 培养基上为蓝色菌落；带有重组质粒转化子由于外源 DNA 片段的插人丧失了 β-半乳糖苷酶活性，因而在 X-gal 和 IPTG 培养基上为白色菌落。

2. 质粒电泳初步鉴定重组子。用无菌牙签挑取白色单菌落接种于含抗生素的 5 mL LB 液体培养基中，于 37 ℃ 振荡培养 12 h。用碱裂解法小量制备质粒 DNA 进行电泳，同时制备 T-vector 做对照，有插人片段的重组质粒电泳时迁移率较 T-vector 慢。

3. 质粒酶切确定重组子。用与连接未端相对应的限制性内切酶对以上电泳中迁移率较慢的质粒进一步进行酶切检验，同时对空载体进行对照酶切，如果确实插人了外源 DNA 片断，就能在电泳中看到与插入片断大小一致的 DNA 条带。

1. 对照 1 上有大量菌落；对照 2 上无菌落；对照 3 上无菌落或有少量菌落；连接体系转化平板上无菌落。可能是感受态细胞效率太低所造成，重新制备高效率感受态。

2. 对照 1 上有大量菌落；对照 2 上无菌落；对照 3 上有较大量菌落；连接体系转化平板上无菌落。可能说明连接效率太低造成，重新调节连接体系以提高连接效率。

3. 对照 1 上有大量菌落；对照 2 上也有菌落；对照 3 上有菌落；连接体系转化平板上有菌落。可能说明感受态细胞受到污染，用新的原始感受态细胞株制备感受态。

4. 对照 1 上有大量菌落；对照 2 上无菌落；对照 3 上有较大量菌落；连接体系转化平板上有适量菌落，但只有蓝色菌落，无白色菌落。可能说明连接体系的效率太低，转化的均为载体自连质粒（T 载体或载体酶切不完全，分离纯化到的载体中含有未双酶切的片断），重新制备片段和载体，调节连接体系，提高连接效率。