双酶切怎么也没切完全，有假阳性怎么办？

dxy_n4jex0k8

2022-04-12

做双酶切和同源重组构建质粒。限制性内切酶上下游都是用的是takara的快切酶，buffer是同一个，温度一样，酶切时间说明书说5分钟，已经延长至四个小时，中间琼脂糖凝胶电泳检测为单条带，然后才全部胶回收。

同源重组用的是monad的kit。做了阴性对照，只放回收线性载体和水，转化后还是能长出抗性菌。是不是说明有没切开的非线性载体呢？

因为此，每次假阳性率就特别高，苦恼苦恼。

bamboopiggy

2022-04-12

有帮助

你先看看你的酶切的接口会不会自连，然后可以做单酶切的对照，是否都可以同时切成线性。

府宅

2022-04-12

有帮助

1、要确定酶切质粒、PCR产物是否完全，
2、连接是载体片段不要加的太多。
你的问题很可能酶切不完全，要看两种酶是否可同时酶切，不行的话就要单酶切啦！

dxy_gwrp7ndq

2022-04-12

有帮助

1)做一个对照,只加载体进行连接,是否有假阳性,看是否酶切完全

2)用PCR进行鉴定可行性不高 ,一定要做阳性对照,排除操作原因.即使阳性有,没有目的条带也不一定可以将其排除 ,因为模板量也会影响,建议提几个质粒酶切看一下,或重复两次

3)怀疑是设计的引物的问题是有没办法鉴定的,扩增后,连到T载体,送去测序.