酶联免疫吸附剂测定细胞分泌蛋白质含量

ELISA 是酶联免疫吸附剂测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）的简称。该方法自 20 世纪 70 年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。ELISA 分为直接法、间接法、双抗体夹心法和竞争性 ELISA，其中每种方法根据检测试剂的不同又分为一些亚类，例如直接法分为酶标抗原的直接法和酶标抗体的直接法，双抗体夹心法又分为直接双抗体夹心法和间接双抗体夹心法。

 

 

 

 

酶联免疫吸附剂测定细胞分泌蛋白质含量的基本过程可分为如下几步，本方法以 PEDF 分子的 ELISA 检测试剂盒为例，介绍直接双抗体夹心法的操作步骤。

试剂盒中已含有包被了小鼠抗人 PEDF 单克隆抗体的 96 孔酶标板，所以省略了包被抗体的步骤。根据试剂盒说明书倍比稀释标准品，配制 0～62.5 ng／ml 的标准品溶液备用。

A. 为排除 PEDF 同其他蛋白分子结合而不能被检测的可能性，必须采用尿素处理样品。首先使用终浓度为 8 mol／L 的尿素冰上处理样品 1 h；采用商品化样品稀释液、PBS 或者含有 1％BSA 的 Tween 以至少 1 : 100 的稀释度稀释样品，以降低样品中的尿素浓度，将尿素对抗原和抗体结合的影响降到最低，处理后的样品必须马上与固相化抗体相结合。

B．向酶标板中加入 100 μl 标准品或者样品，标准品和样品均应做复孔，37 ℃ 孵育 1 h。

C．洗板 4 次。

D．每孔加入 100 μl 稀释好的生物素标记小鼠抗人 PEDF 单克隆抗体，37 ℃ 孵育 1 h。

E．洗板 4 次后，每孔加入 100 μl HRP 偶联的链亲和素，37 ℃ 孵育1 h。

F．将显色底物平衡至室温后，取 100 μl 加入到各反应孔中，室温孵育 5～10min；观察各孔颜色反应的发生情况，当最高浓度标准品（62.5 ng／ml 的标准品）呈现深蓝色时，每孔加入 100 μl 显色终止溶液终止反应。此时反应液从蓝色变成黄色，立即用酶标仪在 450 nm 下检测每孔的吸光度。

G. 数据分析。以 PEDF 标准品的浓度为横坐标，各个标准品在 450 nm 下的吸光度为纵坐标作标准曲线，根据待测样品的吸光度得出样品中 PEDF 的浓度。

 

1.样品的获取与保存

所得样品应立即分装；立即进行实验的样品可保存于 4 ℃，否则应该贮存在 -80 ℃，避免反复冻融。可用作 ELISA 测定的标本十分广泛，如体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等均可用于测定特定抗体或抗原成分的存在。不同样品的处理方法各不相同，可根据实验目的以及试剂盒要求进行处理。例如，细胞培养上清应离心后去除细胞碎片或细胞后再进行实验。为排除细胞培养基对结果的影响，应该使用细胞培养基配制标准品。

2.加样方法

ELISA 实验中加样的方法至关重要，除包被外，加样时移液头与管壁都需呈 45° 角加样；加样体积要准确；加样手法要轻，勿过力；微量移液器的枪头尖端不能过度碰到管底而导致其变弯，也不能加在管壁上；另外，加样时不能产生气泡，气泡会导致读数不准确。

3.洗板

ELISA 实验中洗板不完全会导致背景显色过强，干扰实验结果。目前推荐使用多通道移液器，每次每孔加入 250 μl 洗液进行洗板。弃去洗液时，应倒扣酶标板、甩尽孔内液体，将板扣在吸水性好的纸巾或滤纸上，彻底去除洗液。如此重复 4 次。

4.建议每次 ELISA 实验均应重新进行标准品测定，得到新的标准曲线。