细胞分泌蛋白质的含量测定实验

蛋白质实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

分泌蛋白（secreted protein）是指在细胞内合成后，分泌到细胞外起作用的蛋白质，如消化酶、体液中的部分蛋白成分、抗体和部分激素等。因为分泌蛋白质常存在于成分复杂的体液中，如消化液、血液以及细胞培养的上清中，而且蛋白浓度常相对较低，所以需要使用灵敏度高、特异性好的方法进行分泌蛋白的含量测定。目前，用于细胞可溶性蛋白质的含量测定的方法主要有两种：免疫印迹法和酶联免疫吸附剂测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。

原理

免疫印迹法测定细胞分泌蛋白质含量的基本原理是蛋白质进行免疫印迹之前通过物理或化学的方法使待测样品中的所有蛋白质成分沉淀，一方面去除各种糖、脂质和离子成分的影响，保证电泳效果；另一方面浓缩蛋白质，避免出现假阴性结果。混合物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子量大小进行分离后，在电场中蛋白质分子从凝胶转移到 NC 膜或其他膜上，各个蛋白质条带的相对位置保持不变。然后采用特异性抗体检测目的蛋白质的含量。免疫印迹技术的基本流程如图 10-7 所示。

酶联免疫吸附剂测定细胞分泌蛋白质含量的基本原理是 ELISA 借助酶标记的抗体或抗原在体外与固相化的抗原或抗体相结合，固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定比例。加入底物显色系统，通过酶与底物的相互作用呈现颜色反应，反应颜色的深浅与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。

来源：蛋白质的定性定量分析技术-《医学分子生物学实验技术》药立波第四版

操作方法

免疫印迹法测定细胞分泌蛋白质含量

免疫印迹法（immunoblotting）是对蛋白质混合溶液中目的蛋白进行定性的方法，也是对目的蛋白在不同细胞或者同一种细胞不同条件下的相对含量进行半定量的方法。印迹技术最初用于核酸分子检测，后来人们发现蛋白质在电泳分离之后也可以转移并固定于膜上，因此该方法也用于蛋白质的定性定量分析。相对应于分析 DNA 的 Southern 印迹和分析 RNA 的 Northern 印迹（见第六章），蛋白质印迹

酶联免疫吸附剂测定细胞分泌蛋白质含量

ELISA 是酶联免疫吸附剂测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）的简称。该方法自 20 世纪 70 年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。ELISA 分为直接法、间接法、双抗体夹心法和竞争性 ELISA，其中每种方法根据检测试剂的不同又分为一些亚类，例如直接法分为酶标抗原的直接法和酶标抗体的直接法，双抗体夹心法又