免疫共沉淀技术

一、试剂准备
 

1.  预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机。
 

2.  用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS。

3.  加入预冷的RIPA Buffer(1 ml/10⁷个细胞、10 cm培养皿或150 cm²培养瓶，0.5 ml/5x10⁶个细胞、6 cm培养皿、75 cm²培养瓶）。
 

4.  用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15 min（EP管插冰上，置水平摇床上）。
 

5.  4℃，14000 g离心15 min，立即将上清转移到一个新的离心管中。
 

6.  准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠。
 

7.   每1 ml总蛋白中加入100 ul Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10 min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景。
 

8.   4℃，14000 g离心1 5min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子。
 

9． （Bradford 法）做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）。
 

10.  用PBS将总蛋白稀释到约1 ug/ul，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 ug/ul）。
 

11.  加入一定体积的兔抗到500 ul总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异。
 

12.  4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育。
 

13.  加入100 ul Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1 h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 ul "过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）。
 

14.  14000 rpm瞬时离心5 s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800 ul/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS。
 

15.  用60 ul 2x上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 ul足够上三道）。
 

16.  将上样样品煮5 min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5 min变性。

二、免疫共沉淀反应
 

2． 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1ug相应的抗体加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；
 

3． 取10 ul protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3 000 rpm离心3 min；
 

4.． 将预处理过的10 ul protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4 h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连；
 

5． 免疫沉淀反应后，在4°C 以 3000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1 ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15 ul的2xSDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟；
 

6． SDS-PAGE，Western blotting或质谱仪分析。
 

三、通过免疫共沉淀确定结合蛋白
 

1．用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中；
 

2．将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4℃以最大速度离心15 ；

3．收集上清（约30 ml）并加入30 ug的适当抗体，4℃摇动免疫沉淀物1 h；
 

4．加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液，4℃摇动免疫沉淀物30 min；
 

5．用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重复洗5次。最后，用NETN洗一次；
 

6．吸出混合物的液体部分。加入800 ul的1xSDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4 min；

7．将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10 mA的恒定电流下电泳过夜；
 

8．通过考马斯亮蓝染色观察蛋白质泳带；
 

9．从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1 ml 50%乙腈洗两次，每次3 min；
 

10． 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱；
 

11． 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。

1.  细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质——蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40 或Triton X-100）。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS），细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的。

2.  使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用。

3.  使用对照抗体：

单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗

兔多克隆抗体：正常兔IgG

4.  确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生。

5.  要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀。

6.  确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。

一、免疫共沉淀的优点
 

1.  相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态。

2.  蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响。

3.  可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。


二、免疫共沉淀的缺点
 

1.  可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；

2.  两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；

3.  必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
 

三、RIPA Buffer配制
 

1.  基础成分
 

Tris-HCl（缓冲液成分，防止蛋白变性）
 

NaCl（盐份，防止非特异蛋白聚集）
 

NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用H₂O配制成10%储存液）
 

去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用H₂O配制成10%储存液；避光保存）
 

注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。
 

2.  RIPA蛋白酶抑制剂
 

苯甲基磺酰氟（PMSF）（用异丙醇配制成200 mM的储存液，室温保存）
 

EDTA（钙螯合剂；用H₂O配制成100 mM的储存液，PH 7.4）
 

亮抑酶肽（Leupeptin）（用H₂O配制成1 mg/ml的储存液，分装，-20℃保存）
 

抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H₂O配制成1 mg/ml的储存液，分装，-20℃保存）
 

胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）（用甲醇配制成1 mg/ml的储存液，分装，-20℃保存）
 

3.  RIPA磷酸（酯）酶抑制剂
 

激活的Na₃VO₄（用H₂O配制成200 mM的储存液
 

NaF（200 mM的储存液，室温保存）
 

注意：在准备做磷酸（酯）酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂。
 

四、工作液配制
 

1.  配制100 ml的modified RIPA buffe
 

（1）称取790 mg 的Tris-Base，加到75ml 去离子水中，加入900 mg的NaCl，搅拌，直到全部溶解，用HCl调节PH值到7.4。
 

（2）加10 ml 10%的NP-40。
 

（3）加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清。
 

（4）加1 ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100 ml，2-8℃保存。
 

（5）理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽、亮抑酶肽、胃蛋白酶抑制剂各100 ul；PMSF、Na₃VO₄、 NaF各500 ul），但是PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。