简介
以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
原理
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质——蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质 X 的抗体免疫沉淀 X，那么与 X 在体内结合的蛋白质 Y 也能沉淀下来。目前多用精制的 prorein A 预先结合固化在 argarose 的 beads 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads 上的 prorein A 就能吸附抗原达到精制的目的。
用途
常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
材料与仪器
蛋白质、RIPA Buffer、PBS、Protein A
agarose、琼脂糖、考马斯亮蓝染色液离心机、摇床、 EP 管、细胞刮子、离心管
培养板、电泳仪、电泳槽、高效液相色谱仪
步骤
一、试剂准备
1、预冷 PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机。
2、用预冷的 PBS 洗涤细胞两次，最后一次吸干 PBS。
3、加入预冷的 RIPA Buffer （ 1 ml/107 个细胞、10 cm 培养皿或 150 cm2 培养瓶，0.5 ml/5×106 个细胞、6 cm 培养皿、75 cm2 培养瓶）。
4、用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到 1.5 EP 管中，4 ℃，缓慢晃动 15 min（EP管插冰上，置水平摇床上）。
5、4 ℃，14000 g 离心 15 min，立即将上清转移到一个新的离心管中。
6、准备 Protein A agarose，用 PBS 洗两遍珠子，然后用 PBS 配制成 50% 浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠。
7、每 1 ml 总蛋白中加入 100 ul Protein A 琼脂糖珠（50%），4 ℃ 摇晃 10 min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景。
8、4 ℃，14000 g 离心 15 min，将上清转移到一个新的离心管中，去除 Protein A 珠子。
9、（Bradford 法）做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释 1:10 倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在 -20 ℃ 保存一个月）。
10、用PBS将总蛋白稀释到约 1 ug/ul，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如 10 ug/ul）。
11. 加入一定体积的兔抗到 500 ul 总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异。
12. 4 ℃ 缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温 2 h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用 2 h 室温孵育。
13. 加入 100 ul Protein A 琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4 ℃ 缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温 1 h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加 2 ul「过渡抗体」（兔抗鼠 IgG，兔抗鸡 IgG）。
14. 14000 rpm瞬时离心 5 s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的 RIPA buffer 洗 3 遍，800 ul/遍，RIPA buffer 有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用 PBS。
15. 用 60 ul 2x 上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 ul 足够上三道）。
16. 将上样样品煮 5 min，以游离抗原、抗体、珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻 -20 ℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮 5 min 变性。
二、免疫共沉淀反应
1. 转染后 24~48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂 30 min, 细胞裂解液于 4 °C，最大转速离心 30 min 后取上清；
2. 取少量裂解液以备 Western blot 分析，剩余裂解液加 1 ug 相应的抗体加入到细胞裂解液，4 °C 缓慢摇晃孵育过夜；
3. 取 10 ul protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗 3 次，每次 3000 rpm离心 3 min；
4. 将预处理过的 10 ul protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中 4 °C 缓慢摇晃孵育 2~4 h，使抗体与 protein A 琼脂糖珠偶连；
5. 免疫沉淀反应后，在 4 °C 以 3000 rpm 速度离心 3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用 1 ml裂解缓冲液洗 3~4 次；最后加入 15 ul 的 2x SDS 上样缓冲液，沸水煮 5 分钟；
6. SDS-PAGE，Western blotting 或质谱仪分析。
三、通过免疫共沉淀确定结合蛋白
1. 用磷酸盐缓冲液洗 30 块 10 cm 培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到 1 ml 冰冷的 EBC 裂解缓冲液中；
2. 将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上 4 ℃ 以最大速度离心 15 s ；
3. 收集上清（约 30 ml）并加入 30 ug 的适当抗体，4 ℃ 摇动免疫沉淀物 1 h；
4. 加入 0.9 ml 的蛋白质 A-Sepharose 悬液，4 ℃ 摇动免疫沉淀物 30 min；
5. 用含 900 mmol/L NaCl 的 NETN 洗蛋白 A-Sepharose 混合物，再重复洗 5 次。最后，用 NETN 洗一次；
6. 吸出混合物的液体部分。加入 800 ul 的 1x SDS 胶加样缓冲液到球珠中，煮沸 4 min；
7. 将样品加入到大孔的不连续 SDS-PAGE 梯度胶中，在 10 mA 的恒定电流下电泳过夜；
8. 通过考马斯亮蓝染色观察蛋白质泳带；
9. 从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用 1 ml 50% 乙腈洗两次，每次 3 min；
10. 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱；
11. 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在 ABI 477 A 或 494 A 机器上进行自动 Edman 降解测序。
注意事项
1. 细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质——蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40 或 Triton X-100）。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2％ SDS），细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的。
2. 使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用。
3. 使用对照抗体：单克隆抗体：正常小鼠的 IgG 或另一类单抗兔多克隆抗体：正常兔 IgG。
4. 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生。
5. 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀。
6. 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。
7. 工作液配制
配制 100 ml 的 modified RIPA buffe：
（1）称取 790 mg 的 Tris-Base，加到 75 ml 去离子水中，加入 900 mg 的 NaCl，搅拌，直到全部溶解，用 HCl 调节 PH 值到 7.4。
（2）加 10 ml 10% 的 NP-40。
（3）加 2.5 ml 10% 的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清。
（4）加 1 ml 100 mM 的 EDTA，用量筒定容到 100 ml，2~8 ℃ 保存。
（5）理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽、亮抑酶肽、胃蛋白酶抑制剂各 100 ul；PMSF、Na3VO4、NaF 各 500 ul），但是 PMSF 在水溶液中很不稳定，30 分钟就会降解一半，所以 PMSF 应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定 5 天。
来源：丁香实验
