免疫共沉淀技术
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免疫共沉淀技术
当细胞
在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的蛋白质―蛋白质间的结合被保持下来,因此可用于检测和确定生理条件下相关的蛋白质―蛋白质相互作用。如果实验目的是检测两种特定蛋白质是否在体内存在相互作用,第二种蛋白质通常用免疫印迹方法检测;如果实验目的是发现新的结合蛋白,可以直接对胶上蛋白质进行染色来确定。其实验步骤如下。
(1)用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。
(2)将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4~C以最大速度离心15min。
(3)收集上清液(约30mi)并加入30ug的适当抗体,4~C摇动免疫沉淀物1h。
(4)加入0.9ml的蛋白质A―Sepharose悬液,4~C摇动免疫沉淀物30min。
(5)用含900mmol/LNaCl的NETN洗蛋白A―Sepharose混合物,再重复洗5次。最后,用NETN洗1次。
(6)吸出混合物的液体部分。加入800/Jl的1XSDS胶加样缓冲液到球珠中,煮沸4min。
(7)将样品加入到大孔的不连续SDS―PAGE梯度胶中,在10mA的恒定电流下电泳过夜。
(8)如果实验目的是发现新的结合蛋白,通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。对于实验目的是检测两种特定蛋白质是否在体内存在相互作用,第二种蛋白质通常用免疫印迹方法检测。
(9)如果实验目的是发现新的结合蛋白,从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用1m1 50%乙腈洗两次,每次3min。
(10)用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将肽电洗脱。通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABl 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。