免疫共沉淀技术路线

准备工作：

预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机

1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；

2. 加入预冷的RIPA Buffer(1 ml/107个细胞、10 cm培养皿或150 cm2培养瓶，0.5 ml/5×106个细胞、6 cm培养皿、75 cm2培养瓶)

3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4 ℃，缓慢晃动15 min（EP管插冰上，置水平摇床上）

4. 4 ℃，14000 g离心15 min，立即将上清转移到一个新的离心管中

5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠

6. 每1 ml总蛋白中加入100 μl Protein A琼脂糖珠（50%），4 ℃摇晃10 min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景

7. 4 ℃，14000 g离心15 min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子

8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20 ℃保存一个月）

9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）

10. 加入一定体积的兔抗到500 μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异

11. 4 ℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2 h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育

12. 加入100 μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1 h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl“过渡抗体”（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）

13. 14000 rpm瞬时离心5 s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800 μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS

14. 用60 μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）

15. 将上样样品煮5 min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20 ℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5 min变性。

RIPA Buffer配制：

基础成分:

Tris-HCl（缓冲液成分，防止蛋白变性）

NaCl（盐份，防止非特异蛋白聚集）

NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液）

去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液；避光保存）

注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。

RIPA蛋白酶抑制剂:

苯甲基磺酰氟（PMSF）（用异丙醇配制成200 mM的储存液，室温保存）

EDTA（钙螯合剂；用H2O配制成100 mM的储存液，PH 7.4）

亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1 mg/ml的储存液，分装，-20 ℃保存）

抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1 mg/ml的储存液，分装，-20 ℃保存）

胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）（用甲醇配制成1 mg/ml的储存液，分装，-20 ℃保存）

RIPA磷酸（酯）酶抑制剂：

激活的Na3VO4（用H2O配制成200 mM的储存液，见Sodium Orthovanadate Activation Protoco）
NaF（200 mM的储存液，室温保存）

注意：在准备做磷酸（酯）酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂

工作液配制：

配制100 ml的modified RIPA buffe：

1. 称取790 mg 的Tris-Base，加到75 ml 去离子水中，加入900 mg的NaCl，搅拌，直到全部溶解，用HCl调节PH值到7.4

2. 加10 ml 10%的NP-40

3. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清

4. 加1 ml 100 mM的EDTA，用量筒定容到100 ml，2-8 ℃保存

5. 理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100 µl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 µl），但是PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。

各种成分在工作液中的终浓度：

• Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4
• NP-40: 1%
• 去氧胆酸钠：0.25%
• NaCl: 150 mM
• EDTA: 1 mM
• PMSF: 1 mM
• 抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1 µg/ml
• Na3VO4: 1 mM
• NaF: 1 mM

通过免疫共沉淀确定结合蛋白

1. 用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。

2. 将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4 ℃以最大速度离心15 min。

3. 收集上清（约30 ml）并加入30 μg的适当抗体，4 ℃摇动免疫沉淀物1 h。

4. 加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液，4 ℃摇动免疫沉淀物30 min。

5. 用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重复洗5次。最后，用NETN洗一次。

6. 吸出混合物的液体部分。加入800 μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4 min。

7. 将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10 mA的恒定电流下电泳过夜。

8. 通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。

9. 从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml 50%乙腈洗两次，每次3 min。

10. 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。

11. 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。