RNA 结合蛋白免疫共沉淀法

器材：离心机、磁珠、NanoDrop。

试剂：

① 完全 RIP 裂解液：100 μL 裂解液（150 mmol/L KC1，25 mmol/L Tris pH 7.4，5 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L DTT, 0.5％ NP40）现加 0.5 μL 蛋白酶抑制剂，0.25 μL RNA 酶抑制剂。

② RIP 免疫共沉淀缓冲液：860 μL RIP 清洗液， 35 μL 0.5 mol/L EDTA, 5 μL RNA 酶抑制剂。

③ 蛋白酶 K 缓冲液：117 μL RIP 清洗液， 15 μL 10％ SDS，18 μL 蛋白酶 K（10 mg/mL）。

RNA 结合蛋白免疫共沉淀法的基本过程可分为如下几步：

（一）制备细胞裂解液

A. 收集细胞：

① 贴壁细胞：用 10 mL 预冷 PBS 洗细胞 2 次，将细胞从培养瓶中刮下，转移至离心管中，计数，4 ℃，1500 r/min 离心 5 分钟，弃上清收集细胞。

② 悬浮细胞：收集细胞到 15 mL 离心管中，计数，4 ℃，1500 r/min 离心 5 分钟。弃上清，用 10 mL 预冷 PBS 洗 2 次。

B. 加入准备好的 RIP 裂解液，混匀，在冰上放置 5 分钟。每份样品留存 200 μL 细胞裂解液转移至无核酸酶的离心管中，-80℃ 保存。

（二）准备磁珠

A. 上下颠倒将磁珠完全混匀，转移 50 μL 磁珠至离心管。

B. 加入 500 μL RIP 清洗液，混匀。

C. 将离心管置于磁性分离器中，弃上清。

D. 再加入 500 μL RIP 清洗液，混匀。

E. 再次将离心管置于磁性分离器中，弃上清。加入 100 μL RIP 清洗液，以及 5 μg 抗体。

F. 室温旋转孵育 30 分钟。

G. 离心，并将离心管置于磁性分离器中，弃上清。用 500 μL RIP 清洗液洗 2 次。

（三）免疫共沉淀 RNA 结合蛋白-RNA 复合物

A. 每管加入 900 μL RIP 免疫沉淀缓冲液。

B. 将第一部分已制备好的 RIP 裂解液解冻，4 ℃，14000 r/min 离心 10 分钟。取出 100 μL 上清至准备好磁珠的离心管内，使终体积为 1 mL。4 ℃ 旋转孵育过夜。

C. 剩下上清取出 10 μL 作为 Input，-80 ℃ 冻存。

D. 每管用 500 μL RIP 清洗液洗 6 次。

（四）纯化 RNA

A. 用 150 μL 蛋白酶 K 缓冲液重悬磁珠。

B. Input 样品也加入蛋白酶 K 缓冲液，至总体积 150 μL。

C. 在 55 ℃ 震荡孵育 30 分钟。

D. 离心，将离心管置于磁性分离器中，转移上清至新管子中，再加入 250 μL RIP 清洗液。

E. 各管加入 400 μL 酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）。涡旋 15 秒，14000 r/min 离心 10 分钟。

F. 小心转移 350 μL 液相到新管中。加入 400 μL 氯仿。涡旋 15 秒，14000 r /min 离心 10 分钟。

G. 小心转移 300 μL 液相到新管中，每管加入 50 μL 盐溶液，15 μL 盐溶液II，5 μL 沉淀增强剂，以及 850 μL 纯乙醇，混匀后 -80 ℃ 保存过夜以沉淀 RNA。

H. 4 ℃，14000 r/min 离心 30 分钟，小心弃上清。

L. 用 80％ 乙醇清洗沉淀一次。4 ℃，14000 r/min 离心 15 分钟。小心弃上清，干燥沉淀。

I. 用 10~20 μL DEPC 水重悬，并置于冰上。

（五）分析免疫共沉淀的 RNA

A. RNA 可以用 NanoDrop 等仪器检测浓度及质量，然后用实时荧光定量 PCR（RT-PCR）或者芯片分析以及深度测序等方法来进行检测分析。