RNA的免疫共沉淀分离及检测
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RNA的免疫共沉淀分离及检测
非编码RNA的发现使得RNA领域再次成为了生命科学研究关注的焦点。因为RNA是一种不稳定的生物大分子，绝大多数的RNA都需要与特定的RNA结合蛋白质结合形成RNA/蛋白复合物才能稳定存在于细胞中；不仅如此，RNA与RNA结合蛋白之间的动态关联贯穿和伴随了RNA的转录合成、加工和修饰、胞内运输和定位、功能发挥及降解的整个生命循环。鉴于此，利用RNA结合蛋白分离或发现鉴定功能性RNA分子是RNA研究领域中一个不可或缺的研究方法。简单地说，就是利用RNA结合蛋白的抗体免疫沉淀RNA/蛋白复合物，再从沉淀的RNA/蛋白复合物中分离得到特定RNA结合蛋白的RNA;分离得到的RNA可以通过末端标记和变性胶电泳对RNA分子的大小进行鉴定，也可以利用高通量RNA测序方法对RNA序列进行分析。
●全部所用的溶液试剂均经过DEPC处理或由DEPC水配制。
●RNA抽提过种中乙醇漂洗步骤可以省略。
●RNA样品溶解与保存:TE（pH8。0）缓冲液。80℃（如果下一步操作涉及酶反应）100%de-ionicFormamide（如果下一步是电泳检测）
●熟练的RNA操作非常重要。RNase的污染可通过使用RNAZap处理操作环境得到降低。
1. 由组织或细胞裂解液免疫沉淀RNP复合物
（1）可预先UV照射组织和细胞固定RNA/结合蛋白复合物。
（2）使用预先冰浴冷却的PBS洗组织或细胞两次。
（3）将裂解液加入组织样品中进行匀浆（细胞样品匀浆步骤可省略）。裂解液：
25 mmol/L Tris-HClpH7.5，150 mmol/L KCl，2 mmol/L EDTA，0.5%NP40，1 mmol/L NaF，1 mmol/L DTT，100 U/ml RNasin核糖核酸酶抑制剂，EDTA-free蛋白酶抑制剂。
（4）样品裂解液在4℃下14000 r/min（16000 g）离心10 min，上清液将用于免疫沉淀。
（5）将预平衡的ProteinA/GSepharosebeads与适量的抗体混匀，于4℃旋转混匀6 h左右。
（6）将第3步骤中准备的上清液样品加入beads-抗体混合液中于4℃旋转混匀6 h以上或过夜。结合时间也取决抗体本身的质量和效率。
（7）将混匀液于4℃，1000 r/min离心10 s，弃上清液，用冰浴冷的低盐漂洗液洗beads两次，每次5 min，冰上或4℃进行。随后再用高盐漂洗液洗beads两次，每次5 min，冰上或4℃进行。低盐漂洗液：（高盐漂洗液使用300 mmol/L的NaCl）50 mmol/L Tris-HClpH7.4，150 mmol/L NaCl（300 mmol/L），1 mmol/L MgCl2，0.05%NP40，2 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT，100 U/ml RNasin核糖核酸酶抑制剂。
2. 小分子RNA的抽提
（1）用ProteinaseK溶液重悬beads，55℃消化10 min。
（2）再用常规的TRizol法抽提RNA，用乙醇沉淀。
3. RNA5'端标记和电泳检测
（1）用CalfIntestinalPhosphatase处理抽提得到的RNA，以去掉5'端磷酸基团。
（2）经酚氯仿抽提和乙醇沉淀后，使用γ-32PATP标记RNA分子的5'末端。
（3）将标记后的RNA分子通过15%聚丙烯酰胺尿素变性胶进行电泳分离，随后经放射自显影进行检测。
