酵母RNA提取与分离

 

一、目的：

学习稀碱法提RNA的原理与技术。

二、原理：

由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异，一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验室最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好地除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这2种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法是用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3�4h，迅速冷却，提取液经离心后，上清液用乙醇沉淀RNA。

稀碱法使用稀碱（本实验用0.2%NaOH溶液）使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA（本实验）或调pH2.5利用等电点沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。

酵母含RNA达2.67�10.0%，而DNA含量仅为0.03�0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。

三、器材与试剂：

1．器材：

①干酵母粉（市售）。

②鲜酵母（市售）。

③pH试纸（pH1�10）。

④台天平（100g）。

⑤烧杯100ml（×1）。

⑥量筒50ml（×1）、10ml（×1）。

⑦抽滤瓶500ml（×1）、布氏漏斗φ10cm（×1）。

⑧吸管0.5ml（×1）、1ml（×2）、2ml（×2）、5ml（×1）。

⑨离心机5000r・min-1。

2．试剂：

①0.2%氢氧化钠溶液：2gNaOH溶于蒸馏水并稀释至1000ml。

②乙酸（A・R）。

③95%乙醇。

④无水乙醚（C・P）。

⑤氨水（C・P）。

⑥10%硫酸溶液：浓硫酸（比重1.84）10ml，缓缓 倾于水中，稀释至100ml。

⑦5%硝酸银溶液：5gAgNO3 溶于蒸馏水并稀释至100ml，贮于棕色瓶中。

⑧苔黑酚�三氯化铁试剂：将100mg苔黑酚溶于100ml浓盐酸中，再加入100mgFeCl3 ・6H2 O。临用时配制。

四、操作步骤：

1．RNA的提取：置4g干酵母粉于100ml烧杯中，加入0.2%NaOH溶液40ml，沸水浴加热30分钟，经常搅拌。加入乙酸数滴，使提取液呈酸性（石蕊试纸），离心10�15分钟（4000r・min-1）。取上清液，加入95%乙醇30ml，边加边搅。加毕，静置，待完全沉淀，过滤。滤渣先用95%乙醇洗2次（每次约10ml），继用无水乙醚洗2次（每次10ml），洗涤时可用细玻棒小心搅动沉淀。乙醚滤干后，滤渣即为粗RNA，可作鉴定。

2．鉴定：取上述RNA约0.5g，加10%硫酸液5ml，加热至沸1�2分钟，将RNA水解。

（1）取水解液0.5ml，加苔黑酚�FeCl3试剂1ml，加热至沸1分钟，观察颜色变化。

（2）水解液2ml，加氨水2ml及5%硝酸银溶液1ml，观察是否产生絮状嘌呤银化合物（有时絮状物出现较慢，可放置十几分钟）。