原理
红细胞裂解液选择性裂解红细胞,然后独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解白细胞和灭活细胞RNA酶，然后用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤, 去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的RNase free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。
材料与仪器
鲜血液
抗凝剂 红细胞裂解液RLB 去蛋白液RW1 乙醇 漂洗液RW
制冰机 离心机 离心管 移液枪 移液管 针头 注射器 水浴锅
抗凝剂 红细胞裂解液RLB 去蛋白液RW1 乙醇 漂洗液RW
制冰机 离心机 离心管 移液枪 移液管 针头 注射器 水浴锅
步骤
一、在适合大小的RNase free离心管中加入1体积（<1.5 ml）加入各种抗凝剂新鲜血液 (颠倒混匀后)和3体积的红细胞裂解液RLB，颠倒混匀，可轻弹管壁，确保混匀。
二、室温放置10分钟（期间应该颠倒轻弹混匀数次帮助裂解红细胞）。
如果RNA降解严重，可在冰上裂解，但是时间可长一些以充分裂解。
三、12 000 rpm离心20秒，倒弃红色上清，并小心的尽可能多的吸弃上清（注意不要吸到管底的细胞团），留下完整的管底白细胞团。
离心后在管底应该见到白色的白细胞团，也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起，但是如果看到的是大部分的红色细胞团，说明红细胞裂解很不充分，应该再加入红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤二、三。
上清尽可能的吸弃，残留过多会稀释裂解液，造成裂解结合异常，产量纯度降低。
四、涡旋或者轻弹管壁将白细胞沉淀完全松散重悬，加入350 ul（<0.5 ml全血）或者600 ul（0.5-1.5ml全血）裂解液RLT，吹打混匀后用手剧烈振荡20秒，充分裂解。病人血样中白细胞数量可能大幅增加，应该适当减少处理量。或者按照350 ul（<2x106白细胞）或者600 ul（2x106-1x107白细胞）比例加RTL。
五、用带钝针头的一次性 1 ml(配0.9 mm针头) 注射器抽打裂解物 5-10 次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。
六、较精确估计裂解物体积，加入等体积的70%乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇!），此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
七、立刻将混合物(每次小于700 ul，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13 000 rpm离心60秒，弃掉废液。
八、加700 ul 去蛋白液RW1，室温放置30秒，12 000rpm 离心30秒，弃掉废液。
如果DNA残留明显，可在加入RW1后室温放置5分钟再离心。
九、加入500 ul漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇），12 000 rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500 ul漂洗液RW，重复一遍。
十、将吸附柱RA放回空收集管中，13 000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液， 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
十一、取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50 ul RNase freewater（事先在 70-80℃水浴中加热效果更好）， 室温放置1分钟，12 000 rpm 离心1分钟。
十二、如果提取全血>0.5 ml或者>2x106白细胞，加30-50 ul RNase free water重复步骤十一，合并两次洗脱液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。
洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高，分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15-30%，但是浓度要低，用户根据需要选择。
注意事项
1. 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇。
2. 使用前将10X红细胞裂解液RLB用DEPC处理水稀释到1X。
3. 操作前在裂解液RLT中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如1 ml RLT 中加入10 ul β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的RLT 4℃可放置一个月。
常见问题
1. 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇。
2. 使用前将10X红细胞裂解液RLB用DEPC处理水稀释到1X。
3. 操作前在裂解液RLT中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如1 ml RLT 中加入10 ul β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的RLT 4℃可放置一个月。
来源：丁香实验
