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免疫沉淀

实验分类:

免疫学实验

最新修订时间:

简介

免疫沉淀实验是利用抗原-抗体特异性反应富集靶蛋白的一种方法。目前,用于免疫沉淀实验的方法主要有 5 种:抗体结合蛋白免疫共沉淀法、沉降技术法、串联亲和纯化技术法、染色质免疫共沉淀法和 RNA 结合蛋白免疫共沉淀法。

原理

抗体结合蛋白免疫共沉淀法的基本原理是将抗体加入细胞裂解液共孵育,使之与裂解液中相应的靶蛋白结合,再用蛋白 A/G 或二抗偶联的 Agarose 或 Sepharose 微珠孵育,得到微珠-蛋白 A/G-抗体-靶蛋白复合物沉淀,经过洗涤后,重悬于电泳上样缓冲液,煮沸使抗原与抗体从微珠解离,收集上清中富集的靶蛋白再进行电泳分离和鉴定。

 

免疫沉淀法一般由 6 个基本步骤组成(图 7-1):①裂解细胞;②抗原-抗体免疫复合物形成;③抗原-抗体复合物沉淀;④免疫复合物洗涤;⑤SDS-PAGE 分离抗原-抗体复合物;⑥免疫杂交检测。

 

 

沉降技术法的基本原理是是利用已知的蛋白标签与诱饵蛋白制备融合蛋白,以此融合蛋白钓取目标猎物蛋白。

 

串联亲和纯化技术法的基本原理是将靶蛋白的基因与两个标签基因(如蛋白 A 和钙调蛋白结合肽段,中间用烟草病毒蛋白酶别位点链接)融合后转化至酵母菌或转染至哺乳动物细胞内(图 7-3),待该靶蛋白被适度表达并与其交互作用蛋白质形成复合体后,利用两套亲和性柱层析系统(分别利用 IgG 和钙调素偶联微珠)依序将蛋白质复合体分离纯化出来(图 7-4)。

 

 

 

染色质免疫共沉淀法的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA 复合物,并将其随机切断为 1 kb 左右的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀 DNA-蛋白复合体,特异性地富集与靶蛋白结合的 DNA 片段,通过对目的片断的纯化与检测(图 7-5),从而获得蛋白质与 DNA 相互作用的信息。

 

 

RNA 结合蛋白免疫共沉淀法的基本原理类似染色质免疫共沉淀,用来鉴定与特定 RNA 结合的细胞核或细胞质蛋白(图 7-6)

 

 

 

来源:丁香实验团队

操作方法

抗体结合蛋白免疫共沉淀法

是以抗体和抗原特异性结合作用为基础,用于研究蛋白质相互作用的经典方法,是确定两种蛋白质在哺乳细胞内生理性相互作用的有效方法。

沉降技术法

沉降技术法是近年研究蛋白质相互作用的一种常用技术其特点是利用已知的蛋白标签与诱饵蛋白制备融合蛋白,以此融合蛋白钓取目标猎物蛋白。该方法不需预先制备诱饵蛋白的抗体,方便、简捷,可以用来检测诱饵蛋白与猎物蛋白在细胞外的稳定结合,因此在筛查或研究新发现的相互作用蛋白中被广泛采用,沉降技术常用的有 GST 沉降和 His-Tag 沉降技术。

串联亲和纯化技术法

串联亲和纯化技术法是由 Rigaut 等于 1999 年建立的能快速研究体内蛋白质相互作用的新技术,用于在接近细胞真实生理状态的条件下纯化细胞体内的蛋白质复合体。

染色质免疫共沉淀法(免疫沉淀实验)

染色质免疫共沉淀法是基于体内分析发展的表观遗传信息研究的主要方法。 ChIP 不仅可以检测体内反式因子与 DNA 的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。 近年来,ChIP 与其他方法的结合,扩大了其应用范围,是深入分析转录调控的一种非常有效的工具,ChIP 与基因芯片相结合建立的 ChIP-on-chip 方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;ChIP 与体内足迹

RNA 结合蛋白免疫共沉淀法

RNA 结合蛋白免疫共沉淀法是基因调控在细胞复杂的生命历程(如发育、分化以及对环境的应答)中发挥重要的作用。随着对 RNA 功能的认识,人们对 RNA-蛋白质的相互作用越来越感兴趣。对其的研究不仅涉及转录、翻译、剪切等研究比较透彻的领域,在 RNA 干扰、非编码 RNA 的基因调控等一些新的领域也有所涉及,其中一种调控机制是通过 RNA 结合蛋白(RBP)来调控 mRNA 的翻译过程。

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