沉降技术法

器材：离心机、超声波破碎仪、90 mm 平皿、SDS- PAGE 电泳装置、水浴锅。

试剂：

① l2 x SDS 上样缓冲液;

② Glutathione-Sepharose 4B 凝胶;

③ PBS 缓冲液。

沉降技术法的基本过程可分为如下几步，本方法以 GST 沉降技术为例介绍：

（一）GST 诱饵融合蛋白制备

A. 表达 GST 诱饵融合蛋白的大肠杆菌经超声波破碎，12000r/min，4℃ 离心 30 分钟，取上清

B. 加入 2 ml 柱床体积的 Glutathione-Sepharose 4B 凝胶，4℃ 旋转混合 1 小 时

C.1000r/min 离心 3 分钟，弃上清，10 倍柱床体积的 PBS 洗凝胶 3 次，即为制备的 GST 诱饵融合蛋白-Glutathione-Sepharose 4B 凝胶。

（二）含有猎物蛋白的细胞裂解液制备

A. 悬浮细胞：1400r/min，4℃ 离心 2 分钟收集细胞，用预冷 5 ml PBS 洗涤两遍，然后按 1 ml/10 个细胞用预冷的 RIPA 缓冲液来裂解细胞，冰上放置 20-60 分钟，12 000r/min 离心 20 分钟，回收上清，即为细胞的蛋白裂解液。

B. 贴壁细胞：取预冷的 5 ml PBS 漂洗两次，加入细胞裂解液 1 ml（90 mm 平皿），直接裂解细胞并移入 1.5 ml 离心管中 4℃，12 000r/min 离心 20 分钟→回收上清，即为细胞的蛋白裂解液。细胞裂解液短期可 4℃ 保存或于-80℃ 长期保存。

（三）共沉降实验

A. 每 200-500 μg 细胞裂解液中加入 20-50μl Glutathione-Sepharose 4B 凝胶预清除， 4℃ 旋转混合 60 分钟；2000r/min，4℃ 离心 5 分钟，回收上清液。

B. 之后在上清中加入 20-50μl GST 诱饵融合蛋白-Glutathione-Sepharose 4B 凝胶，4℃ 旋转混合 1-2 小时，2000r/min，离心 30 秒，弃上清，并用 20 倍凝胶体积的 1xPBS 洗涤凝胶 3 次。

（四）猎物蛋白检测

A. 加入 20μl 2 x SDS 上样缓冲液，100℃ 煮沸 3-5 分钟，1000r/min 离心 1 分钟，之后进行 SDS-PAGE 电泳和 Western blotting 检测。

1. 常用融合标签和结合配体见表 7-4

2. 在操作的每一步骤预留样品，用于免疫印迹分析 细胞裂解液（检测靶蛋白的表达水平）；洗脱前微珠（用于检测诱饵蛋白的含量）；洗涤液（检测 GST 融合蛋白和靶蛋白在洗涤过程中是否丢失）；洗脱后微珠（检测微珠中是否有 GST-融合蛋白和靶蛋白残留）。在用免疫印迹检测靶蛋白的同时，要检测 GST-融合蛋白的含量，确保样品中所用的 GST-融合蛋白的量一致，同时能明确 GST-融合蛋白在操作过程中是否有降解。