提问
提问
我要登录
|免费注册
点赞
收藏
wx-share
分享

沉降技术法

相关实验:免疫沉淀

最新修订时间:

简介

沉降技术法是近年研究蛋白质相互作用的一种常用技术其特点是利用已知的蛋白标签与诱饵蛋白制备融合蛋白,以此融合蛋白钓取目标猎物蛋白。该方法不需预先制备诱饵蛋白的抗体,方便、简捷,可以用来检测诱饵蛋白与猎物蛋白在细胞外的稳定结合,因此在筛查或研究新发现的相互作用蛋白中被广泛采用,沉降技术常用的有 GST 沉降和 His-Tag 沉降技术。

材料与仪器

器材:离心机、超声波破碎仪、90 mm 平皿、SDS- PAGE 电泳装置、水浴锅。
试剂:
① l2 x SDS 上样缓冲液;
② Glutathione-Sepharose 4B 凝胶;
③ PBS 缓冲液。


步骤

沉降技术法的基本过程可分为如下几步,本方法以 GST 沉降技术为例介绍:

(一)GST 诱饵融合蛋白制备

A. 表达 GST 诱饵融合蛋白的大肠杆菌经超声波破碎,12000r/min,4℃ 离心 30 分钟,取上清

B. 加入 2 ml 柱床体积的 Glutathione-Sepharose 4B 凝胶,4℃ 旋转混合 1 小 时

C.1000r/min 离心 3 分钟,弃上清,10 倍柱床体积的 PBS 洗凝胶 3 次,即为制备的 GST 诱饵融合蛋白-Glutathione-Sepharose 4B 凝胶。

(二)含有猎物蛋白的细胞裂解液制备

A. 悬浮细胞:1400r/min,4℃ 离心 2 分钟收集细胞,用预冷 5 ml PBS 洗涤两遍,然后按 1 ml/10 个细胞用预冷的 RIPA 缓冲液来裂解细胞,冰上放置 20-60 分钟,12 000r/min 离心 20 分钟,回收上清,即为细胞的蛋白裂解液。

B. 贴壁细胞:取预冷的 5 ml PBS 漂洗两次,加入细胞裂解液 1 ml(90 mm 平皿),直接裂解细胞并移入 1.5 ml 离心管中 4℃,12 000r/min 离心 20 分钟→回收上清,即为细胞的蛋白裂解液。细胞裂解液短期可 4℃ 保存或于-80℃ 长期保存。

(三)共沉降实验

A. 每 200-500 μg 细胞裂解液中加入 20-50μl Glutathione-Sepharose 4B 凝胶预清除, 4℃ 旋转混合 60 分钟;2000r/min,4℃ 离心 5 分钟,回收上清液。

B. 之后在上清中加入 20-50μl GST 诱饵融合蛋白-Glutathione-Sepharose 4B 凝胶,4℃ 旋转混合 1-2 小时,2000r/min,离心 30 秒,弃上清,并用 20 倍凝胶体积的 1xPBS 洗涤凝胶 3 次。

(四)猎物蛋白检测

A. 加入 20μl 2 x SDS 上样缓冲液,100℃ 煮沸 3-5 分钟,1000r/min 离心 1 分钟,之后进行 SDS-PAGE 电泳和 Western blotting 检测。


注意事项

1. 常用融合标签和结合配体见表 7-4

2. 在操作的每一步骤预留样品,用于免疫印迹分析 细胞裂解液(检测靶蛋白的表达水平);洗脱前微珠(用于检测诱饵蛋白的含量);洗涤液(检测 GST 融合蛋白和靶蛋白在洗涤过程中是否丢失);洗脱后微珠(检测微珠中是否有 GST-融合蛋白和靶蛋白残留)。在用免疫印迹检测靶蛋白的同时,要检测 GST-融合蛋白的含量,确保样品中所用的 GST-融合蛋白的量一致,同时能明确 GST-融合蛋白在操作过程中是否有降解。


来源:丁香实验

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
关注公众号
反馈
TOP
打开小程序