土井挞克树
可以的,六孔板可以做细胞免疫共沉淀
huarenqiang5
细胞免疫共沉淀可以用6孔板的细胞做。具体步骤如下:
1). 使用预冷的PBS洗涤细胞3遍;
2). 加入免疫共沉淀裂解液(10 cm盘加入2.5~3 mL,6孔板加入0.5 mL/孔),置4℃摇床,摇晃30分钟;
3). 枪尖吹打收集蛋白,12000×g,4℃,10分钟离心,收集蛋白上清;
4). 将一抗加入EP管,每个样品5 μL;
5). 将蛋白上清分装入相应EP管中,每管1.2 mL;
6) .置于4℃,立体旋转摇晃过夜;
7) 取凝胶珠连接的protein A/G,每个样品取30 μL;
8) 使用免疫共沉淀裂解液洗涤protein A/G珠子,每次1 mL,1000~2000×g,4℃,1 分钟,离心去上清,重复三遍;
9) 加入适量裂解液重悬protein A/G的凝胶珠(可按每样品最终加入30~40 μL protein A/G 的溶液量加入适量裂解液重悬);
10) 置于4℃,立体旋转摇晃,4~8小时;
(11) 配免疫沉淀洗涤溶液,用PBS对半稀释免疫共沉淀裂解液;
12) 1000~2000×g,4℃,1分钟离心去上清;
13) 加入免疫沉淀洗涤溶液每管1 mL,上下颠倒重悬洗涤,1000~2000×g,4℃,1分钟离心去上清,重复5遍;
14) 加入80~100 μL 2 X loading buffer (含DTT),轻弹混匀,于98℃水浴煮5分钟;
15) 每个样品取20 μL通过Western检测相应蛋白。
秋秋欣欣
可以,只要你六孔板细胞数量够就行。
dxy_9njnv24q
你好,请问你是否尝试过6孔板做免疫共沉淀?孔内长满就可以吗?我担心蛋白数量不够细胞量不够这些导致做不出来
loveliufudan
以下是一种细胞免疫共沉淀的实验步骤,适用于细胞板上进行:
1. 处理细胞:在6孔板中培养和处理您感兴趣的细胞,根据实验设计进行适当的处理,如刺激、转染等。
2. 细胞裂解:使用适当的细胞裂解缓冲液将细胞裂解,以释放细胞内的蛋白质。具体的裂解缓冲液配方和处理方法会根据实验的目的和所研究的蛋白质而有所不同。
3. 预清:将细胞裂解液进行离心,以去除细胞碎片和细胞核等杂质。收集上清液并转移至新的离心管中。
4. 抗体结合:将特异性的抗体添加到上清液中,允许抗体与目标蛋白质结合。
5. 免疫沉淀:将抗体与目标蛋白质结合的混合物加入含有沉淀剂(如蛋白A/G琼脂糖或蛋白A/G磁珠)的管中。允许混合物在较低温度下搅拌,以促进抗体-蛋白质复合物的形成。
6. 沉淀洗涤:使用适当的洗涤缓冲液洗涤免疫沉淀复合物,以去除非特异性的结合物和杂质。
7. 沉淀复苏:使用洗涤缓冲液或其他合适的方法将免疫沉淀的复合物从沉淀剂中解离,并收集上清液。
8. 蛋白质分析:使用Western blotting、质谱等方法对沉淀的蛋白质进行分析,以确认目标蛋白与抗体的相互作用。
sswei
细胞免疫共沉淀可以用6孔板的细胞去做。
免疫共沉淀(Co-IP)步骤
(1) 使用预冷的PBS洗涤细胞3遍;
(2) 加入免疫共沉淀裂解液(10 cm盘加入2.5~3 mL,6孔板加入0.5 mL/孔),置4℃摇床,摇晃30分钟;
(3) 枪尖吹打收集蛋白,12000×g,4℃,10分钟离心,收集蛋白上清;
(4) 将一抗加入EP管,每个样品5 μL;
(5) 将蛋白上清分装入相应EP管中,每管1.2 mL;
(6) 置于4℃,立体旋转摇晃过夜;
(7) 取凝胶珠连接的protein A/G,每个样品取30 μL;
(8) 使用免疫共沉淀裂解液洗涤protein A/G珠子,每次1 mL,1000~2000×g,4℃,1 分钟,离心去上清,重复三遍;
(9) 加入适量裂解液重悬protein A/G的凝胶珠(可按每样品最终加入30~40 μL protein A/G 的溶液量加入适量裂解液重悬);
(10) 置于4℃,立体旋转摇晃,4~8小时;
(11) 配免疫沉淀洗涤溶液,用PBS对半稀释免疫共沉淀裂解液;
(12) 1000~2000×g,4℃,1分钟离心去上清;
(13) 加入免疫沉淀洗涤溶液每管1 mL,上下颠倒重悬洗涤,1000~2000×g,4℃,1分钟离心去上清,重复5遍;
(14) 加入80~100 μL 2 X loading buffer (含DTT),轻弹混匀,于98℃水浴煮5分钟;
(15) 每个样品取20 μL通过Western检测相应蛋白。
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