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🔥 细胞免疫共沉淀实验(Co-IP)

相关实验:免疫共沉淀(Co-IP)

别名:CO-IP,蛋白免疫共沉淀,蛋白相互结合,(Co-Immunoprecipitation),COIP,蛋白互作,蛋白质相互作用

最新修订时间:

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合作专家 | 孙汉寅硕士

生物与医药学 中国科学院大学

简介

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)是一种利用抗原与抗体之间的专一性为基础,广泛应用于研究蛋白质与蛋白质相互作用的经典研究方法。

CO-IP与GST-pulldown方法比较
方法 优点 缺点
CO-IP 反应蛋白在天然状态下的结合情况,真实可信 不能确定蛋白之间的结合是直接还是间接的结合
GST-pulldown 能确定蛋白之间是否有直接相互作用 GST分子量较大,可能会影响蛋白之间的相互结合、不能确定天然状态下蛋白之间是否有作用

原理

其原理是如果细胞内两蛋白(A、B)有直接或间接的相互作用时,那么在温和的裂解条件下获得的蛋白样品中加入 A 蛋白的抗体将 A 蛋白沉淀下来,在细胞内与 A 蛋白直接相互作用的 B 蛋白或与其间接相互作用的 C 蛋白能一起被沉淀下来。

使用western blot检测沉淀中是否存在 B 或 C 蛋白来确定 B 或 C 蛋白与 A 蛋白的相互作用。

用途

1.检测 A、B 蛋白在体内是否相互结合

2.分离与 A 蛋白相互作用的蛋白复合物

材料与仪器

【样品和试剂】

293T 细胞(以该细胞做转染为例)、转染质粒(Flag-A,HA-B) 、flag 抗体、2Ⅹ loading buffer、PBS、Flag-beads、1X TBST、5X SDS loading buffer、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂 A 和 B、RIPA 裂解液;

【实验仪器】

磁力架、金属浴、RIPA 裂解液旋转混合仪、WB 实验相关设备。

步骤

一、细胞的铺板与转染

1、提前一晚将 293T 细胞铺板至 6 cm 皿中,铺板量以达到相应的转染试剂要求为准;

2、用各实验室相应的转染试剂将以下质粒组合转染 2 皿细胞:flag 空载+HA-B;flag-A+HA-B;每质粒 2 微克。

二、免疫沉淀

1、转染 24 小时后,收获细胞,每皿加入 500 μL 裂解液,收集细胞至1.5 mL EP 管中,在冰上超声破碎细胞;

2、超声好后,4℃,12,000 g,离心 30 分钟,取 400 μL 上清液用于免疫沉淀,80 μL 上清用作总蛋白并加入等体积的 2Ⅹ loading buffer;

3、将 400 μL 上清加入用裂解液清洗了 3 遍的 beads 中,加入0.3-0.5 μg flag 抗体,4℃ 孵育 3-4 小时;

4、4℃,2,000 g,离心 3 分钟,去除未结合的液体,留下 beads 沉淀,用预冷的蛋白裂解液清洗沉淀 3 次,每次 5 分钟;

5、最后一次去除清洗液,往沉淀中加入 60 μL 2Ⅹ loading buffer,和总蛋白一起在沸水中煮沸 15 分钟。

三、Western Blot 检测

1、通过 SDS-PAGE 分离样品,利用全蛋白样品作为对照,检测 flag-A 和 HA-B 蛋白是否发生结合。

注意事项

1.对于内源的 Co-IP 检测应该用 10 cm 皿来培养目的细胞,并维持较好的生长状态;

2.如果该实验用于新蛋白的鉴定,应注意抗体重链和轻链的影响;

3.该实验不能确定蛋白之间的相互作用是直接还是间接的。

常见问题

1、阴性有较强的条带

这有可能是结合较弱或清洗不干净导致的

2、内源的 Co-IP 实验结合较弱或者不结合

可能是蛋白表达较弱,建议做过表达的 Co-IP

来源:丁香实验

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