🔥 细胞免疫共沉淀实验（Co-IP）

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是一种利用抗原与抗体之间的专一性为基础，广泛应用于研究蛋白质与蛋白质相互作用的经典研究方法。

CO-IP与GST-pulldown方法比较

方法	优点	缺点
CO-IP	反应蛋白在天然状态下的结合情况，真实可信	不能确定蛋白之间的结合是直接还是间接的结合
GST-pulldown	能确定蛋白之间是否有直接相互作用	GST分子量较大，可能会影响蛋白之间的相互结合、不能确定天然状态下蛋白之间是否有作用

其原理是如果细胞内两蛋白（A、B）有直接或间接的相互作用时，那么在温和的裂解条件下获得的蛋白样品中加入 A 蛋白的抗体将 A 蛋白沉淀下来，在细胞内与 A 蛋白直接相互作用的 B 蛋白或与其间接相互作用的 C 蛋白能一起被沉淀下来。

使用western blot检测沉淀中是否存在 B 或 C 蛋白来确定 B 或 C 蛋白与 A 蛋白的相互作用。

1.检测 A、B 蛋白在体内是否相互结合

2.分离与 A 蛋白相互作用的蛋白复合物

【样品和试剂】

293T 细胞（以该细胞做转染为例）、转染质粒（Flag-A，HA-B) 、flag 抗体、2Ⅹ loading buffer、PBS、Flag-beads、1X TBST、5X SDS loading buffer、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂 A 和 B、RIPA 裂解液；

【实验仪器】

磁力架、金属浴、RIPA 裂解液旋转混合仪、WB 实验相关设备。

一、细胞的铺板与转染

1、提前一晚将 293T 细胞铺板至 6 cm 皿中，铺板量以达到相应的转染试剂要求为准；

2、用各实验室相应的转染试剂将以下质粒组合转染 2 皿细胞：flag 空载+HA-B；flag-A+HA-B；每质粒 2 微克。

二、免疫沉淀

1、转染 24 小时后，收获细胞，每皿加入 500 μL 裂解液，收集细胞至1.5 mL EP 管中，在冰上超声破碎细胞；

2、超声好后，4℃，12,000 g，离心 30 分钟，取 400 μL 上清液用于免疫沉淀，80 μL 上清用作总蛋白并加入等体积的 2Ⅹ loading buffer；

3、将 400 μL 上清加入用裂解液清洗了 3 遍的 beads 中，加入0.3-0.5 μg flag 抗体，4℃ 孵育 3-4 小时；

4、4℃，2,000 g，离心 3 分钟，去除未结合的液体，留下 beads 沉淀，用预冷的蛋白裂解液清洗沉淀 3 次，每次 5 分钟；

5、最后一次去除清洗液，往沉淀中加入 60 μL 2Ⅹ loading buffer，和总蛋白一起在沸水中煮沸 15 分钟。

三、Western Blot 检测

1、通过 SDS-PAGE 分离样品，利用全蛋白样品作为对照，检测 flag-A 和 HA-B 蛋白是否发生结合。

1.对于内源的 Co-IP 检测应该用 10 cm 皿来培养目的细胞，并维持较好的生长状态；

2.如果该实验用于新蛋白的鉴定，应注意抗体重链和轻链的影响；

3.该实验不能确定蛋白之间的相互作用是直接还是间接的。

1、阴性有较强的条带

这有可能是结合较弱或清洗不干净导致的

2、内源的 Co-IP 实验结合较弱或者不结合

可能是蛋白表达较弱，建议做过表达的 Co-IP