蛋白质相互作用

1. 为了转化文库，将约20 ml 含pSH18-34和pBait 的酵母菌EGY48培养液接种到Glc/CM-Ura-His 省却成分液体培养基中，于30℃培养过夜。2. 将过夜培养液稀释到300 ml Glc/CM-Ura-His 省却成分液体培养基中，浓度约为2×106细胞/ml（OD600≈0.10），于30℃培荞至菌密度约为1×107细胞/ml（OD600≈0.50）。 3. 室温

捕捉相互作用蛋白的第一步是构建能够表达 LexA 与目的蛋白的融合体的质粒。这种质粒转化到包含 LEU2 和lacZ 报道基因的报道酵母株中，并要行一系列的对照实验来鉴定所构建的诱饵蛋白是否适用，是否需要修饰，或是否应改变酵母菌报道条件。这些对照实验实现了诱饵蛋白在酵母菌中作为一种稳定蛋白质合成、可进入细胞核并与 LexA 操纵子位点结合、不激活基于 LexA 操纵子的报道基因的转录。LexA 融

蛋白质-蛋白质相互作用在真核生物的各项生命活动中发挥重要作用。与其它蛋白质互作研究技术相比，借助于烟草瞬时表达系统的萤火素酶互补实验（LCA）具有简单、灵敏、可靠、高效和低背景等优点，并可轻松扩展为大规模蛋白质互作的筛选和验证研究。

CETSA（Cellular Thermal Shift Assay，细胞热转移实验）是一种检测细胞内药物与靶蛋白结合效率的实验，其原理是靶蛋白与药物分子结合时通常会变得稳定。随着温度的升高，蛋白会发生降解；当蛋白结合药物后，相同温度下，未降解蛋白的量会提高，该复合蛋白的热熔曲线会右移。其样品来源可以是细胞，也可以是组织，检测方法主要有免疫印迹（Western blotting）和蛋白质谱（MS）

表面等离子共振（SPR）是借助传统光学现象，利用光在不同介质中产生消逝波后与等离子波产生共振，进而可以构建生物分子相互作用的生物传感分析技术，实时跟踪在天然状态下生物分子间的相互作用，用以检测生物传感芯片上配位体与分析物之间的相互作用情况。

Far western 实验主要是利用标记的探针蛋白通过凝胶电泳分离的目的蛋白质，从而探测和检测膜上的目标蛋白与探针蛋白是否具有相互作用。

Biacore是基于表面等离子体共振（SPR）技术来实时跟踪在天然状态下生物分子间的相互作用，无需任何标记物。表面等离子体共振（surface plasmonresonance，SPR）是一种光学现象，在传感芯片发生全反射界面上有一层约50nm厚的金属膜，偏振光入射到棱镜的一端，在棱镜与金属膜的界面会产生表面等离子波，当入射光波的传播常数与表面等离子波的传播常数匹配时，金属膜内的自由电子会产生共振

双分子荧光互补技术 (Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC) 在实验室中主要用于判断目的蛋白在活体细胞中的定位和是否发生相互作用，最早由普渡大学 Hu （2002） 等人开发研究，特点是操作简便、结果直观。

材料 缓冲液和溶液 将缓冲液稀释到适当浓度。 碱性缓冲液 20 mmol/L HEPES(pH7.5) 50 mmol/LKCl 10 mmol/LMgCl2 1 mmol/L 二硫苏糖醇 0.1%NP-40 封闭缓冲液 5% 脱脂奶粉于碱性缓冲液中 相互作用缓冲液 1% 脱脂奶粉于碱性缓冲液中 2xPK 缓冲液 100 mmol/LKPO4(英文版原书如此—译者注） 20 mmol/L

PLA 技术全称为 Proximity Ligation Assay，是看得见的蛋白互作新技术，即便是微量样本、微弱或者瞬时的互作以及低丰度的表达，也能在内源水平可视化目的蛋白的互作、定位和定量。并且该技术可将蛋白信号放大千倍，灵敏度高、特异性好。不仅如此，该技术操作简单，用时短，仅需一天即可得到结果。

第一阶段 用荧光染料标记蛋白质 材料 缓冲液和溶液 将储备溶液稀释到适当的浓度。 用 NaOH 调节的 N-二羟乙基甘氨酸（0.1mol/L,PH7.5) 用 NaOH 调节的 N-二羟乙基甘氨酸（1mol/L,pH9.0~9.5) 消化缓冲液 20 mmol/L 磷酸钠 10 mmol/LEDTA 20 mmol/L 半胱氨酸/HCl 缓冲液（pH7.0) N,N-二甲基甲酰胺（D

实验要经过两次连续大量的酵母菌平板筛选过程。酵母菌含有 LexA 融合探针、报道基因和插入PJG4-5（见图19.1.6）的 GAL 启动子控制下的 cDNA 表达文库。最近，已有可供用于这个系统的文库。

一、抗体阵列的制备 要了解关于蛋白质阵列制备的详细介绍，可查阅本章介绍中的「10.8.2 制作蛋白质阵列」部分。要了解梗概，参见方案11。 1.将捕获抗体溶于含 40% 甘油（体积分数）的 PBS(pH7.5) 中，使其终浓度达到 0.5 mg/ml。缓冲液中不能含有亲核性成分（如 Tris)。 抗体常常会与 BSA 竞争性地与玻片发生连接反应。可用蛋白 G 或蛋白 A 的亲和层

一、蛋白标记1.将染料溶人 250 μl 水中，每 10 μg 待标记蛋白中，加入 5μl 的染料溶液。蛋白质浓度不能低于 100 μg/ml。在这样的条件下，蛋白质被标记的程度与蛋白质浓度无密切关系。虽然制造商推荐标记时的 pH 值为 9.3，但一般都在 pH 值为 7.5 的 PBS 缓冲液中进行标记。低 pH 有利于染料和蛋白质的氨基末端相连，而高 pH 值则导致染料与赖氨酸残基发生非选择性

以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

荧光显微镜检查法，荧光染料用 Hoechst 33258，它是一种能与 DNA 特异结合的荧光染料。支原体内含有 DNA，能着色，是现有检测法中最方便和最有效的一种。

染色质免疫共沉淀-芯片/序列分析技术，是指染色质免疫共沉淀与 DNA 芯片以及二代测序结合的技术。

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是一种利用抗原与抗体之间的专一性为基础，广泛应用于研究蛋白质与蛋白质相互作用的经典研究方法。CO-IP与GST-pulldown方法比较方法优点缺点CO-IP反应蛋白在天然状态下的结合情况，真实可信不能确定蛋白之间的结合是直接还是间接的结合GST-pulldown 能确定蛋白之间是否有直接相互作用 GST分子量较大，可能会影响

实验方案 A1.向含有 Dynabeads 的每个试管中加入下列物质：2.65℃ 下酶解 Ih(每 IOmin 混合 1 次)。3.时收集上清液（含有释放的 cDNA 标签）4.用 LoTE 扩容到 200mL。5.等体积的 PCI 抽提，乙醇沉淀（实验方案 A，第 2 步）。6.将冲洗和风干后的沉淀重新悬浮于 10 ul LoTE 中。 实验方案 B1.从 PCR 试管中移去连接反应混合物并用

酵母双杂交系统(yeast two-hybrid)以酵母遗传分析为基础，研究反式作用因子之间相互作用对真核基因转录调控影响的实验系统。其最有价值的应用是用 BD-X 筛选由 AD-Y 构成的 cDNA 文库，以获得新的蛋白质之间的相互作用，并分析研究新的基因。本技术不仅可用于鉴定新的蛋白质相互作用，证实可疑的相互作用，确定相互作用的结构域，而且可直接获得编码相互作用的蛋白的基因。