荧光素酶互补验证蛋白互作

蛋白质-蛋白质相互作用在真核生物的各项生命活动中发挥重要作用。与其它蛋白质互作研究技术相比，借助于烟草瞬时表达系统的萤火素酶互补实验（LCA）具有简单、灵敏、可靠、高效和低背景等优点，并可轻松扩展为大规模蛋白质互作的筛选和验证研究。

以萤火素（luciferin）为底物来检测萤火素酶（luciferase）的活性。具体而言，在实验中，萤火素酶蛋白被切成 N 端和 C 端 2 个功能片段，即NLuc（2–416 aa）和 CLuc（398–550 aa）（Luker et al.，2004；Chen et al.，2008）。

在一个实验体系中，待检测的 2 个目标蛋白分别与 NLuc 和 CLuc 融合，如果 2 个目标蛋白相互作用，则萤火素酶的 NLuc 和 CLuc 在空间上会足够靠近并正确组装，从而发挥萤火素酶活性，即分解底物产生荧光。

用于哺乳动物细胞内蛋白质互作研究以及检测植物蛋白质-蛋白质的相互作用。

本氏烟草、目标蛋白基因序列、pCAMBIA1300-NLuc（pNL）质粒、pCAMBIA1300-CLuc（pCL）质粒、农杆菌感受态细胞（GV3101）、LB 培养基、蛋白提取液、乙酰丁香酮、1/2 MS 培养基、萤火素（D-luciferin）、anti-luciferase antibody、anti-CLuc antibody、1 mL 注射器、5 mL 小喷雾器、0.6 cm 直径打孔器、96 孔酶标板、蛋白电泳系统等。

一、融合蛋白表达载体的构建

1. 利用 pNL 和 pCL 中的酶切位点，将目标基因与报告基因融合，获得含有目标基因的重组质粒。

2. 将构建好的重组质粒分别转化 GV3101，28 °C 恢复培养 40 分钟，涂于 LB 板上（含 50 μg·mL^–1 卡那霉素和 50 μg·mL^–1 庆大霉素），28 °C 培养过夜。

二、烟草注射

1. 挑取转化有重组质粒的农杆菌单菌落，接种到 2 mL LB 液体培养基中（含 50 μg·mL^–1 卡那霉素和 50 μg·mL^–1 庆大霉素），28 °C，220 rpm 培养过夜。

2. 农杆菌培养至 OD₆₀₀ 为 1.0，1700×g 离心 5 分钟收集菌体后， 用 1/2 MS 液体培养基清洗菌体 2 次；用含有 150 μmol∙L^–1 乙酰丁香酮的 1/2MS 液体培养基将每种菌的 OD₆₀₀ 值调至 1.0。

3. 将待检测的 2 种农杆菌菌液按照 1:1 体积比进行混合，使每种菌液的 OD₆₀₀ 值为 0.5。

4. 选取生长期为 1 个月左右完全伸展的烟草叶片，将混合好的菌液用 1 mL 注射器（去掉针头）从烟草叶背面进行注射。

5. 正常温室生长条件下，24~48 小时即可取样观察。

三、观察萤火素酶活性

1. 选取注射农杆菌 24~48 小时后的烟草叶片， 用含 1 mmol∙L^–1 萤火素底物 D-luciferin 的反应液喷湿叶片背面；将烟草植株在黑暗中静置 7 分钟。

2. 截取烟草叶片，将其反面向上置于培养皿中，移入植物活体成像系统中检测发光情况。如果有发光，即说明待测蛋白之间存在互作。

3. 选取注射农杆菌 40~48 小时后的烟草叶片，用打孔器（直径约 0.6 cm）打孔，将烟草圆片转移到含有 200 μL 无菌水的白色 96 孔酶标板中。

4. 用排枪移走 96 孔酶标板内的无菌水，加入 200 μL 含有 1 mmol∙L^–1 萤火素底物的反应液，孵育 5~10 分钟。

5. 使用 luminometer 进行荧光扫描，扫描间隔时间为 0.5 秒，25~40 个循环。根据扫描的数值绘制柱形图，以显示萤火素酶分解底物后产生荧光的强度，判断目标蛋白之间的互作程度。此实验重复 3 次。

四、蛋白检测

1. 将等量检测后的烟草叶片置于 1.5 mL 离心管中，加入 400 μL 蛋白裂解液，用研磨棒研碎叶片，或置于研钵中研磨以破碎细胞。

2. 取破碎后的样品进行离心，收集上清液，加入 4×蛋白上样缓冲液，100 °C 煮 5 分钟， 离心收集蛋白提取液。

3. 利用常规方法，通过 SDS-PAGE 胶分离蛋白，WB 检测蛋白表达。含有 NLuc 的融合蛋白可以用 anti-luciferase 抗体检测；连有 CLuc 的融合蛋白可以通过 anti-CLuc 抗体来检测。

1. 烟草注射中的第 4 步，为保证实验结果的一致性，需要将对照载体和待检测目标载体的菌液注射在同一叶片的不同部位上，以保证相同的生长背景。相同的菌液至少注射 3~5 枚烟草叶片以利于后续的实验观察；第 5 步中为保证蛋白在烟草叶片中的表达效果，可以通过加盖塑料壳来保持湿度。

2. 观察萤火素酶活性的第 2 步，为了保证实验的准确性和一致性，同一株烟草至少选取 3 个重复进行荧光检测，此操作重复 3 次；第 3 步中，为了保证实验的准确性，同一烟草注射部位至少设 8 个重复；进行第 4 步时在操作过程中移液器的枪头尽量不要触碰叶片，避免应激反应。

3. 蛋白检测表达的重要性。判定蛋白之间的互作是建立在融合蛋白都可以正确表达的基础之上，只有各融合蛋白都正确表达才能判断目标蛋白之间是否存在相互作用。