蛋白质相互作用检测
最新修订时间：
合作专家 | 唐婕妤硕士
临床医学 中南大学
审核专家 | 黄玥琳博士
生理学 大连医科大学
简介
PLA 技术全称为 Proximity Ligation Assay，是看得见的蛋白互作新技术，即便是微量样本、微弱或者瞬时的互作以及低丰度的表达，也能在内源水平可视化目的蛋白的互作、定位和定量。并且该技术可将蛋白信号放大千倍，灵敏度高、特异性好。
不仅如此，该技术操作简单，用时短，仅需一天即可得到结果。
原理
PLA 技术是一种特殊的免疫分析方法，首先将不同种属的两个一抗分别与目的蛋白（目的蛋白是同一个蛋白的两个区域或者两个互相结合的蛋白，下面都以两个蛋白为例）孵育，然后加入耦联了寡聚脱氧核苷酸（单链 DNA）的二抗，即 PLA probe（探针），如果目的蛋白相互作用，两个探针之间的距离就会很近，产生邻近效应。
加入与探针互补的寡聚脱氧核苷酸（杂交溶液）和连接酶，寡聚脱氧核苷酸就会形成闭环。
加入聚合酶，就能以其中一条探针作为模板，滚环复制不断形成新的闭环，这些环化 DNA 都与探针有着互补片段，聚集在探针，也就是目的蛋白在细胞中原本的位置。
最后，加入荧光素标记的寡核苷酸（检测溶液）与环化的 DNA 作用，一个环化的 DNA 可以与上百上千个荧光素标记的寡核苷酸结合，形成蛋白质的原位检测或者相互作用检测。
应用
定位、定量、可视化检测蛋白质相互作用、检测目标蛋白。
来源：Alam MS. Proximity Ligation Assay （PLA）。 Curr Protoc Immunol. 2018 Nov;123（1）：e58. doi: 10.1002/cpim
操作方法
PLA 技术全称为 Proximity Ligation Assay，是看得见的蛋白互作新技术，即便是微量样本、微弱或者瞬时的互作以及低丰度的表达，也能在内源水平可视化目的蛋白的互作、定位和定量。并且该技术可将蛋白信号放大千倍，灵敏度高、特异性好。不仅如此，该技术操作简单，用时短，仅需一天即可得到结果。
双分子荧光互补（BiFC）对体内蛋白质之间的相互作用的可视化分析双分子荧光互补技术 (Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC) 在实验室中主要用于判断目的蛋白在活体细胞中的定位和是否发生相互作用，最早由普渡大学 Hu （2002） 等人开发研究，特点是操作简便、结果直观。
等离子共振技术（SPR）检测蛋白质相互作用一、样品稀释1.配体蛋白用 PBS（ pH = 7.4）稀释。2.分析物用 PBS（pH = 7.4）稀释。二、实验流程1. 按照 OpenSPRTM 仪器标准操作程序安装生物素（NTA）芯片。2. 开始以最大流速（150 uL/min）运行，检测缓冲液为 PBS（PH 7.4）。3. 达到信号基线后，调整缓冲液流速到 20 uL/min，上样 200 uL 的 IPA（异丙醇），运行 10 s
Far western检测蛋白质相互作用Far western 实验主要是利用标记的探针蛋白通过凝胶电泳分离的目的蛋白质，从而探测和检测膜上的目标蛋白与探针蛋白是否具有相互作用。
🔥 细胞热转移实验（CETSA）1、将构建好的质粒瞬时转染到 HEK 293T 细胞中进行体内细胞热移实验 (CETSA)。2、按照制造商的方案转染 HEK 293T 细胞 8 小时，随后将细胞暴露于 DMSO 或者 elaiophylin 中 24 小时，收集细胞，用含有蛋白酶抑制剂 （1 mmol/L PMSF 或者 50×cocktail） 的 PBS 洗涤。对照细胞用相同体积的 PBS 孵育。3、细胞培养计数后，用 PB
荧光素酶互补验证蛋白互作蛋白质-蛋白质相互作用在真核生物的各项生命活动中发挥重要作用。与其它蛋白质互作研究技术相比，借助于烟草瞬时表达系统的萤火素酶互补实验（LCA）具有简单、灵敏、可靠、高效和低背景等优点，并可轻松扩展为大规模蛋白质互作的筛选和验证研究。
相关产品推荐
相关问答
