双分子荧光互补（BiFC）对体内蛋白质之间的相互作用的可视化分析

双分子荧光互补技术 (Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC) 在实验室中主要用于判断目的蛋白在活体细胞中的定位和是否发生相互作用，最早由普渡大学 Hu （2002） 等人开发研究，特点是操作简便、结果直观。

荧光蛋白可以从特定的位点被分开，分成两个不能产生荧光活性的非活性片段， 即 N 端片段 (N-fragment) 和 C 端片段 (C-fragment)。当能够发生相互作用的两个蛋白质分别与 N 端片段和 C 端片段相连时，它们因相互作用而靠近、融合，从而将荧光蛋白的 N 端片段和 C 端片段相互拉近，重新形成有活性的荧光蛋白，在激发作用下可以发出荧光，通过荧光显微镜可以直观地判断目的蛋白的互作情况。

验证蛋白质互作，广泛应用于模式植物、动物、微生物和病毒的染色体、RNA、细胞融合等相关领域，也可用于药物研发。

1） 载体和植物材料：含有目的基因的载体、农杆菌感受态、本氏烟草 （Nicotiana benthamiana） 等；

2） 主要试剂：酵母提取物 （Yeast extract）、胰蛋白胨 （Tryptone）、琼脂粉、MES (4-morpHolineethanesulfonic acid)、MgCl₂、乙酰丁香酮 (acetosyringone, AS)、利福平 （Rifampicin）、氨苄青霉素 (Ampicillin, Amp) 等；

3） 所需用品和仪器：50 mL 离心管、1 mL 注射器、载玻片、盖玻片、低温离心机、分光光度计、激光共聚焦显微镜等。

1、试剂配制

1.1 100 μg/mL Amp：2 g Ampicillin 粉末溶解于 16 mL 去离子水中，去离子水定容至 20 mL，过滤除菌，分装、-20 °C 保存；

1.2 25 mg/mL Rif：0.5 g 利福平粉末溶于 DMSO 中，定容至 20 mL，分装、-20 °C 保存；

1.3 500 mM MES （pH = 5.6）：9.75 g 无水 MES 溶解于去离子水中，经 NaOH 调 pH 至 5.6 并定容至 100 mL，过滤除菌、4 °C 保存；

1.4 100 mM 乙酰丁香酮：0.196 g 乙酰丁香酮溶于 5 mL DMSO 中，去离子水定容至 10 mL，过滤除菌，分装、-20 ℃ 保存；

1.5 100 mM MgCl₂：1.0165 g MgCl₂·6H₂O 溶于去离子水中并定容至 50 mL，-20 ℃ 保存；

1.6 100 mL 浸染液：2 mL 500 mM MES + 0.15 mL 100 mM AS + 10 mL 100 mM MgCl₂，去离子水溶解并定容至 100 mL。

2、烟草种植

在 14 h 光照 / 10 h 黑暗、25 °C、相对湿度 70% 的温室中培育烟草幼苗 4~5 周，挑选大小合适、长势健康的烟草备用。

3、构建包含目的基因的载体

本实验所用的质粒构建方法为同源重组，重组后测序无误即可。其结构示意图如下图所示：

注：YFP^N 为黄色荧光蛋白的 N 端片段，YFP^C 为黄色荧光蛋白的 C 端片段。

4、重组质粒转农杆菌

将构建好的表达质粒转化至农杆菌感受态中，转化方式参照感受态自带说明书进行。

注：GV3101、EHA105、LBA4404 这三种农杆菌均可以用于烟草瞬时转化，在培养农杆菌时除添加载体所含有的抗生素外，不同农杆菌还需要添加其它相应种类的抗生素；本实验室所用农杆菌为 GV3101，所以需要添加利福平。

5、农杆菌侵染

5.1 小摇菌种：挑取含有有表达质粒的农杆菌单克隆于 1 mL 含有相应抗生素的 LB 培养基中，28 ℃、200 rpm 摇培 24 h 至菌液稍稍浑浊；

5.2 大摇菌种：将 1 mL 培养的农杆菌菌液接至 20 mL 含有相应抗生素的 LB 培养基中，向培养基中加入 15 μM 乙酰丁香酮（20 mL 的 LB 液体培养基中加入 3 μL 的 100 mM AS），28 °C、200 rpm 摇培至农杆菌生长的对数期 (OD₆₀₀ = 0.5 - 0.6）；

5.3 侵染：室温条件下 5,000 rpm 离心 10 min，收集菌体，浸染液（含 10 mM MgCl₂、 10 mM MES、150 μM 乙酰丁香酮，pH = 5.6）重悬菌体，调整液体 OD₆₀₀ = 1.0，室温静置 2～3 h（不少于 0.5 h，最长不超过 3 h）；

5.4 烟草注射：吸取菌液后，去掉 1 mL 注射器的针头，手指抵住叶片的正面，注射器从背面注射进烟草叶片中，记号笔标记烟草叶片水渍状区域，注射过的烟草植株于黑暗下放置 12 h，25 °C 继续培养至 24～36 h。

6、观察和记录结果

滴一滴水在载玻片上，撕取标记区域的烟草叶片置于水中，盖上盖玻片，在激光共聚焦显微镜下观察荧光蛋白的表达情况。

1. 本实验中，烟草须选择长势健康的叶片，过于幼嫩或衰老的叶片容易影响侵染结果；时间建议在下午 1~3 点钟进行，此时烟草叶片的气孔打开，侵染液容易注射进叶片；

2. 侵染液的 OD 值为经验值，注射烟草时 OD₆₀₀ = 1.0 应用较为广泛，实际操作中，OD 值过高容易导致叶片枯萎，影响实验结果，建议进行预实验，在能观察到荧光信号的基础上，选择尽可能低的浓度；

3. 不同基因的表达效率不同，共转之前建议分别进行单转，检测每个基因的荧光信号强度，根据其表达情况改进共转的条件；

4. 无论是烟草、水稻等植物，还是稻曲、稻瘟菌等病原真菌，均存在自发荧光的问题，观察植物时，共聚焦显微镜建议采用 505～530 nm 的发射滤光片，避免植物细胞自发荧光的干扰；

5. 共转验证蛋白之间是否互作有时存在假阳性现象，建议同时设置阴性和阳性对照校对实验结果，并后续结合酵母双杂、Co-IP 等实验相互验证。

最主要的问题是观察不到荧光信号或信号较弱，在明确已知目的蛋白之间存在互作的基础上，提出以下几点建议：

1. 片段互补对体系温度非常敏感，如果培养细菌或真菌细胞，建议略低于室温 （25 ℃） 进行；

2. 目的基因中存在较难被受体细胞识别的段片段或序列，建议构建载体之前对目的基因的序列进行密码子优化；

3. 荧光信号较弱时，可以考虑在载体的荧光片段和目的蛋白之间加一个连接肽，或者换用优化后的增强型荧光蛋白。