RNA－蛋白质的相互作用1

叶绿体RNA的体外加工与紫外交联分析RNA

RNA的合成

 

 

l      DNA 模板的线性化

 

1． 根据供应商的指导用合适的限制酶酶解含有 DNA 模板（如亚克隆在转录载体如 pBluescript^® （ Stratagene ）上的菠菜叶绿体 psbA 基因）的质粒（ Schuster and Gruissem1991 ）。

2． 用 DNA 琼脂凝胶（ Sambrook et al. 1989 ）分析线性化质粒以检查酶解是否完全。

3． 用乙醇沉淀 DNA （ Sambrook et al. 1989 ），并重悬 DNA 沉淀于水中，调整线性 DNA 终浓度为 200 μ g/ml 。

 

 

l      DNA 模板的转录

 

1． 向微量离心管加入下列反应液

DNA 模板                                     2 μ l （ 0.4 μ g ）

反应缓冲液（ 5 ×）                                     4 μ l

DTT （ 40mmol/L ）                                    0.5 μ l

NTP 混合液（用于 H － RNA 或 X － RNA ）                  2 μ l

RNA 酶抑制剂                          0.5 μ l （约 15 单位）

H₂ O              对 H － RNA 加 8.5 μ l 或对 X － RNA 加 2.5 μ l

为避免 DNA 的亚精胺沉淀，须在室温或 37 ℃加各种试剂。

 

 

注： H － RNA 用于体外加工测试； X － RNA 用于 UV 交联测试

 

NTP 混合液（ H － RNA 用）： 5 mmol/L GTP ， CTP ， ATP   0.25mmol/L UTP

 

NTP 混合液（ X － RNA 用）： 5 mmol/L GTP ， CTP ， ATP

2． 向反应液中加入 2 μ l （对 H-RNA ）或 8 μ l （对 X-RNA ）α -[³² P]UTP 。

3． 加 0.5 ～ 1 μ l （即 10 ～ 20 单位） SP6 ， T3 或 T7 聚合酶使反应终体积为 20 ～ 20.5 μ l 。

4． 37 ℃温育 40 ～ 60 分钟。

5． 加入 15 μ l 5mol/L 乙酸胺和 100 μ l 100 ％乙醇沉淀 RNA 。

6． － 20 ℃放置 10 分钟， 4 ℃离心 10 分钟。

7． 弃上清，空气和真空干燥 RNA 沉淀，用 7 μ l 甲酰胺染液重悬 RNA 。

8． 在沸水中将 RNA 重悬液煮 3 分钟后，于冰上快速冷却，加样于 6 ％的变性丙稀酰胺凝胶。

9． 用 Saran^® 膜包上凝胶，对 X 光片曝光约 20 秒。

10．  切下含有 RNA 的凝胶片放入 1.5ml 微量离心管中。

11．  在该离心管中加入：

DEPC 处理过的水                               180 μ l

DEPC 处理过的乙酸钠（ 3mol/L, pH5.5 ）           20 μ l

DEPC 处理过的 EDTA （ 0.25mol/L ）                   1 μ l

SDS （ 20 ％）                                     1 μ l

12．  在 65 ℃温育 1 ～ 1.5 小时或 40 ℃下过夜使 RNA 从凝胶中扩散出来。

13．  将 RNA 液转移入新的微量离心管中，加入 500 μ l 100 ％乙醇，－ 20 ℃放置 10 分钟。计数契仑科夫辐射。

14．  离心 10 分钟沉淀 RNA ，弃去上清，真空下干燥沉淀，在进入下一操作前用合适的缓冲液重悬 RNA 。