RNA－蛋白质的相互作用2

叶绿体 mRNA3’ 末端的体外加工

 

l      RNA 加工反应

 

1． 在 1.5ml 微量离心管中加入下列反应液：

缓冲液 IVT （ 20 ×）                             0.5 μ l

叶绿体蛋白提取物（ 20 μ g ）                       L μ l

缓冲液 E                                        M μ l

（ L ＋ M ＝ 5 μ l ）

DEPC 处理过的水                                 X μ l

H-RNA （约 0.25fmol ，每分钟计数 2000 ）            Y μ l

（ X ＋ Y ＝ 4.5 μ l ）

以加入 H － RNA 起始反应，温和混匀，短暂离心使反应液从管壁上甩下来。

注：

 

缓冲液 IVT （ 20 ×）： 200 mmol/L KCl, 75 mmol/L MgCl2, 40 mmol/L 二硫苏糖醇（ DTT ）   用 DEPC 处理后高压灭菌。

 

缓冲液 E ： 20 mmol/L HEPES （ pH7.9 ）， 60 mmol/L KCl, 12.5 mmol/L MgCl2, 0.1 mmol/L EDTA, 2mmol/L 二硫苏糖醇（ DTT ）， 17 ％甘油    用 DEPC 处理后高压灭菌。

 

2． 25 ℃温育 60 分钟（或对于动力学实验为 0 ～ 60 分钟）。

3． 将 5 μ l 反应液中移入 45 μ l 终止液以终止反应，混匀，置于冰上。

终止反应液：

 

6 mol/L 尿素

 

1 ％十二烷基硫酸钠（ SDS ）

 

4.5 mmol/L 玫瑰红三羧酸    

 

用 DEPC 处理并高压灭菌

4． 加入 50 μ l 酚 / 氯仿 / 异戊醇（ 25 ： 25 ： 1 ），混匀，室温下离心 2 分钟。把上层水相（红色）移到新离心管中，弃掉酚相。

5． 再加入 1 μ l 3mol/L 乙酸钠（ pH5.5 ）， 1 μ l 10mg/ml tRNA ， 125 μ l 100 ％冰冷乙醇。－ 20 ℃放置 10 分钟后， 4 ℃离心 10 分钟。

6． 小心移去上清，将 RNA 沉淀真空干燥约 5 分钟后，重悬 RNA 于 7 μ l 甲酰胺染液中。

7． 沸水浴煮 RNA 重悬液 3 分钟，冰上快速冷却。

 

 

l      用 PAGE 分析 RNA 产物

 

1． 准备电泳装置，用洗涤剂洗玻璃板（ 18cm × 18cm × 0.08cm ），依次用水，蒸馏水和乙醇冲洗，然后空气晾干。

2． 制备 6 ％丙稀酰胺凝胶液：

溶液 A                                    4.8ml

溶液 B                                    7.2ml

APS （ 20 ％）                                55 μ l

TEMED                                    8 μ l

倒胶，插入梳子，丙稀酰胺将 30 分钟内完全聚合。

注：

溶液 A ： 5 × TBE （用 10 × TBE 贮液）， 7 mol/L 尿素， 15 ％丙稀酰胺， 0.75 ％双丙稀酰胺

溶液 B ： 0.5 × TBE （用 10 × TBE 贮液）， 7mol/L 尿素

3． 电泳缓冲液为 0.5 × TBE ， 30mA 下，预电泳直到温度上升为 50 ℃或电压上升至 1000V （需要约 20 分钟）。

4． 用电泳缓冲液冲洗泳道以除去预电泳中扩散汇集于泳道的尿素。上 RNA 样，在 20mA 下走胶至溴酚蓝到达胶的底部（ 20 ～ 30 分钟）。

5． 小心地分开上下玻璃板，把胶移到 Whatman 3MM 纸上，盖上 Saran^® 膜，再放上一层 Whatman 3MM 纸于 Saran^® 膜上，置于凝胶干燥器上干燥。

6． 用增感屏于－ 80 ℃，干凝胶 X 光片曝光 6 ～ 15 小时。

蛋白质与 RNA 的交联

 

l      UV 交联反应

 

1． 在 1.5ml 微量离心管中加入下来反应物（ X-RNA 除外）：

缓冲液 IVT （ 20 ×）                                0.75 μ l

叶绿体蛋白提取物（ 20 μ g ）                            L μ l

缓冲液 E                                          M μ l

（ L ＋ M ＝ 7.5 μ l ）

poly （ U ）（ 0.1mg/ml ）                                 1 μ l

DEPC 处理过的水                                    X μ l

X-RNA （约 1.25fmol, 每分钟计数 100 000 ）              Y μ l

（ X ＋ Y ＝ 6.5 μ l ）

总体积：                                          15.75 μ l

室温下放置 5 分钟，加入 X-RNA ，温和混合，短暂离心，将反应液从管壁上甩下来。

2． 室温下放置 10 分钟。

3． 小心地打开管盖，放至 UV 交联仪下，在工作功率 1.8J （即刻度为 2 × 9000 ）进行 UV 交联，如果没有 UV 交联仪，可在杀菌灯下 6cm 照 30 分钟。

4． 加入 1 μ l 0.5mg/ml RNase A 液，在 37 ℃温育 20 分钟。

5． 加入 4 μ l × Laemmli 样品缓冲液，在 80 ～ 100 ℃下处理样品 1 分钟。

 

 

l      蛋白质的 SDS － PAEG 电泳分析

 

1． 准备制胶装置，洗玻璃板，可选用 18cm × 18cm × 0.08cm 玻璃板或 8cm × 10cm （微型凝胶）玻璃板。

2． 制备 13 ％丙稀酰胺分离胶溶液：

丙稀酰胺（ 30 ％） / 双丙稀酰胺（ 0.8 ％）                8.7ml

H₂ O                                              8.8ml

分离胶缓冲液（ 8 ×）                                2.5 μ l

APS （ 20 ％）                                         75 μ l

TEMED                                             30 μ l

3． 制备浓缩胶溶液：

丙稀酰胺（ 30 ％） / 双丙稀酰胺（ 0.8 ％）                  1.3ml

H₂ O                                                3.9ml

浓缩胶缓冲液（ 4 ×）                                   1.8ml

APS （ 20 ％）                                          45 μ l

TEMED                                               10 μ l

4． 在 20mA 直流下电走胶直至溴酚蓝到达胶的底部（ 2 ～ 3 小时）。

5． 小心分开玻璃板，把胶移入玻璃皿中，按下列程序银染蛋白。

 

 

l      阳性成像银染

 

按 Merril 等 1984 的方法，下述的步骤均在室温下进行。

1． 在含有 50 ％甲醇 /12% 冰乙酸的 400ml 水溶液中处理 10 分钟以固定凝胶。换用新溶液重复一次。

2． 在含有 10 ％甲醇 /5 ％冰乙酸水溶液 400ml 中处理 10 分钟以漂洗凝胶。换用新溶液重复一次。

3． 将胶浸入含 3.4mmol/L 重铬酸钾 /3.2mmol/L 硝酸 200ml 水溶液中 15 分钟。

4． 将胶浸入含 12mmol/L 硝酸银的 150ml 水溶液中，放置 15 分钟。

5． 用水漂洗 3 次。

6． 在含有 0.5ml 37 ％甲醛溶液的 0.28mol/L 碳酸钠 150ml 溶液中快速洗胶两次后，换上 150ml 新鲜溶液，让凝胶显像 3 ～ 15 分钟。

7． 去掉显像剂，加入 200ml 3 ％乙酸水溶液，放置 5 分钟终止显像。

8． 用 5 ％甘油 200ml 水溶液漂洗成像凝胶 10 分钟。

9． 在约 80 ℃凝胶干燥器上干燥成像凝胶，用增感屏－ 80 ℃对 X 光片曝光过夜。