RNA－蛋白质的相互作用2
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叶绿体 mRNA3’ 末端的体外加工
l RNA 加工反应
1． 在 1.5ml 微量离心管中加入下列反应液：
缓冲液 IVT （ 20 ×） 0.5 μ l
叶绿体蛋白提取物（ 20 μ g ） L μ l
缓冲液 E M μ l
（ L ＋ M ＝ 5 μ l ）
DEPC 处理过的水 X μ l
H-RNA （约 0.25fmol ，每分钟计数 2000 ） Y μ l
（ X ＋ Y ＝ 4.5 μ l ）
以加入 H － RNA 起始反应，温和混匀，短暂离心使反应液从管壁上甩下来。
注：
缓冲液 IVT （ 20 ×）： 200 mmol/L KCl, 75 mmol/L MgCl2, 40 mmol/L 二硫苏糖醇（ DTT ） 用 DEPC 处理后高压灭菌。
缓冲液 E ： 20 mmol/L HEPES （ pH7.9 ）， 60 mmol/L KCl, 12.5 mmol/L MgCl2, 0.1 mmol/L EDTA, 2mmol/L 二硫苏糖醇（ DTT ）， 17 ％甘油 用 DEPC 处理后高压灭菌。
2． 25 ℃温育 60 分钟（或对于动力学实验为 0 ～ 60 分钟）。
3． 将 5 μ l 反应液中移入 45 μ l 终止液以终止反应，混匀，置于冰上。
终止反应液：
6 mol/L 尿素
1 ％十二烷基硫酸钠（ SDS ）
4.5 mmol/L 玫瑰红三羧酸
用 DEPC 处理并高压灭菌
4． 加入 50 μ l 酚 / 氯仿 / 异戊醇（ 25 ： 25 ： 1 ），混匀，室温下离心 2 分钟。把上层水相（红色）移到新离心管中，弃掉酚相。
5． 再加入 1 μ l 3mol/L 乙酸钠（ pH5.5 ）， 1 μ l 10mg/ml tRNA ， 125 μ l 100 ％冰冷乙醇。－ 20 ℃放置 10 分钟后， 4 ℃离心 10 分钟。
6． 小心移去上清，将 RNA 沉淀真空干燥约 5 分钟后，重悬 RNA 于 7 μ l 甲酰胺染液中。
7． 沸水浴煮 RNA 重悬液 3 分钟，冰上快速冷却。
l 用 PAGE 分析 RNA 产物
1． 准备电泳装置，用洗涤剂洗玻璃板（ 18cm × 18cm × 0.08cm ），依次用水，蒸馏水和乙醇冲洗，然后空气晾干。
2． 制备 6 ％丙稀酰胺凝胶液：
溶液 A 4.8ml
溶液 B 7.2ml
APS （ 20 ％） 55 μ l
TEMED 8 μ l
倒胶，插入梳子，丙稀酰胺将 30 分钟内完全聚合。
注：
溶液 A ： 5 × TBE （用 10 × TBE 贮液）， 7 mol/L 尿素， 15 ％丙稀酰胺， 0.75 ％双丙稀酰胺
溶液 B ： 0.5 × TBE （用 10 × TBE 贮液）， 7mol/L 尿素
3． 电泳缓冲液为 0.5 × TBE ， 30mA 下，预电泳直到温度上升为 50 ℃或电压上升至 1000V （需要约 20 分钟）。
4． 用电泳缓冲液冲洗泳道以除去预电泳中扩散汇集于泳道的尿素。上 RNA 样，在 20mA 下走胶至溴酚蓝到达胶的底部（ 20 ～ 30 分钟）。
5． 小心地分开上下玻璃板，把胶移到 Whatman 3MM 纸上，盖上 Saran® 膜，再放上一层 Whatman 3MM 纸于 Saran® 膜上，置于凝胶干燥器上干燥。
6． 用增感屏于－ 80 ℃，干凝胶 X 光片曝光 6 ～ 15 小时。
蛋白质与 RNA 的交联
l UV 交联反应
1． 在 1.5ml 微量离心管中加入下来反应物（ X-RNA 除外）：
缓冲液 IVT （ 20 ×） 0.75 μ l
叶绿体蛋白提取物（ 20 μ g ） L μ l
缓冲液 E M μ l
（ L ＋ M ＝ 7.5 μ l ）
poly （ U ）（ 0.1mg/ml ） 1 μ l
DEPC 处理过的水 X μ l
X-RNA （约 1.25fmol, 每分钟计数 100 000 ） Y μ l
（ X ＋ Y ＝ 6.5 μ l ）
总体积： 15.75 μ l
室温下放置 5 分钟，加入 X-RNA ，温和混合，短暂离心，将反应液从管壁上甩下来。
2． 室温下放置 10 分钟。
3． 小心地打开管盖，放至 UV 交联仪下，在工作功率 1.8J （即刻度为 2 × 9000 ）进行 UV 交联，如果没有 UV 交联仪，可在杀菌灯下 6cm 照 30 分钟。
4． 加入 1 μ l 0.5mg/ml RNase A 液，在 37 ℃温育 20 分钟。
5． 加入 4 μ l × Laemmli 样品缓冲液，在 80 ～ 100 ℃下处理样品 1 分钟。
l 蛋白质的 SDS － PAEG 电泳分析
1． 准备制胶装置，洗玻璃板，可选用 18cm × 18cm × 0.08cm 玻璃板或 8cm × 10cm （微型凝胶）玻璃板。
2． 制备 13 ％丙稀酰胺分离胶溶液：
丙稀酰胺（ 30 ％） / 双丙稀酰胺（ 0.8 ％） 8.7ml
H2 O 8.8ml
分离胶缓冲液（ 8 ×） 2.5 μ l
APS （ 20 ％） 75 μ l
TEMED 30 μ l
3． 制备浓缩胶溶液：
丙稀酰胺（ 30 ％） / 双丙稀酰胺（ 0.8 ％） 1.3ml
H2 O 3.9ml
浓缩胶缓冲液（ 4 ×） 1.8ml
APS （ 20 ％） 45 μ l
TEMED 10 μ l
4． 在 20mA 直流下电走胶直至溴酚蓝到达胶的底部（ 2 ～ 3 小时）。
5． 小心分开玻璃板，把胶移入玻璃皿中，按下列程序银染蛋白。
l 阳性成像银染
按 Merril 等 1984 的方法，下述的步骤均在室温下进行。
1． 在含有 50 ％甲醇 /12% 冰乙酸的 400ml 水溶液中处理 10 分钟以固定凝胶。换用新溶液重复一次。
2． 在含有 10 ％甲醇 /5 ％冰乙酸水溶液 400ml 中处理 10 分钟以漂洗凝胶。换用新溶液重复一次。
3． 将胶浸入含 3.4mmol/L 重铬酸钾 /3.2mmol/L 硝酸 200ml 水溶液中 15 分钟。
4． 将胶浸入含 12mmol/L 硝酸银的 150ml 水溶液中，放置 15 分钟。
5． 用水漂洗 3 次。
6． 在含有 0.5ml 37 ％甲醛溶液的 0.28mol/L 碳酸钠 150ml 溶液中快速洗胶两次后，换上 150ml 新鲜溶液，让凝胶显像 3 ～ 15 分钟。
7． 去掉显像剂，加入 200ml 3 ％乙酸水溶液，放置 5 分钟终止显像。
8． 用 5 ％甘油 200ml 水溶液漂洗成像凝胶 10 分钟。
9． 在约 80 ℃凝胶干燥器上干燥成像凝胶，用增感屏－ 80 ℃对 X 光片曝光过夜。
