原理
荧光显微镜检查法，荧光染料用 Hoechst 33258，它是一种能与DNA 特异结合的荧光染料。支原体内含有DNA，能着色，是现有检测法中最方便和最有效的一种。
材料与仪器
细胞
Hanks 醋酸甲醇 蒸馏水
盖片 显微镜
Hanks 醋酸甲醇 蒸馏水
盖片 显微镜
步骤
1. 标本
盖片培养细胞汇合前从瓶中取出（如细胞已完全汇合，能影响对支原体的观察）；
2. 漂洗
将细胞盖片置于碟皿中，用不含酚红的Hanks液漂洗；如为细胞悬液则先离心去上清营养液后，再加入Hanks液漂洗；
3. 固定
用醋酸甲醇（1：3）固定10 分钟；
4. 漂洗
用生理盐水或去离子水漂洗，处理方法同2；
5. 染色
置于33258（用不含酚红的Hanks 或生理盐水配制，浓度为50 μg/ml）中染色10 分钟；
6. 漂洗
置于蒸馏水漂洗1～2 分钟，处理方法同2；
7. 观察
从蒸馏水中取出细胞盖片，令细胞面向上，滴pH5.5 的磷酸缓冲液数滴，覆以24×36 mm2大盖片，置荧光显微镜下观察；如用细胞悬液则先离心，去上清蒸馏水，加3~5 滴上述磷酸缓冲液，稍吹打使沉淀细胞重悬浮，用吸管吸出，滴于载物片上，覆以盖片后观察。荧光显微镜下可见支原体呈亮绿色小点，散在细胞周围，或附于细胞表面。
盖片培养细胞汇合前从瓶中取出（如细胞已完全汇合，能影响对支原体的观察）；
2. 漂洗
将细胞盖片置于碟皿中，用不含酚红的Hanks液漂洗；如为细胞悬液则先离心去上清营养液后，再加入Hanks液漂洗；
3. 固定
用醋酸甲醇（1：3）固定10 分钟；
4. 漂洗
用生理盐水或去离子水漂洗，处理方法同2；
5. 染色
置于33258（用不含酚红的Hanks 或生理盐水配制，浓度为50 μg/ml）中染色10 分钟；
6. 漂洗
置于蒸馏水漂洗1～2 分钟，处理方法同2；
7. 观察
从蒸馏水中取出细胞盖片，令细胞面向上，滴pH5.5 的磷酸缓冲液数滴，覆以24×36 mm2大盖片，置荧光显微镜下观察；如用细胞悬液则先离心，去上清蒸馏水，加3~5 滴上述磷酸缓冲液，稍吹打使沉淀细胞重悬浮，用吸管吸出，滴于载物片上，覆以盖片后观察。荧光显微镜下可见支原体呈亮绿色小点，散在细胞周围，或附于细胞表面。
来源：丁香实验
