凋亡指数和细胞活力的定量测定（荧光染色法）

将细胞悬液与DNA结合的荧光染料混合，应用荧光显微镜观察以显示和计数伴有异常染色质的组织细胞。常用染料为丫啶橙，染色后可以检测整个细胞群中有多少细胞发生了凋亡，但不能区别活细胞和死细胞。因此将丫啶橙和溴化乙啶混合使用，根据两种染料的吸收情况可鉴定死、活细胞。

一、材料与试剂

100μg/ml丫啶橙或100μg/ml丫啶橙与100μg/ml溴化乙啶的混合物：分别用PBS配制（两种染色剂均系诱变物，操作时应十分小心）。

用完全RPMI-1640培养液配制的细胞悬液，浓度为5×105 ～5×106 /ml。

二、操作步骤

分装有1μl染液的试管内加入25μl细胞悬液，轻轻摇匀（所加溶液均置管底），置室温5～10 min；

将此混悬液取出10μl 置于洁净载玻片上，加盖玻片，用荧光显微镜观察；

三、结果分析

若用丫啶橙作细胞染色，计数200个细胞总数，并记录与凋亡细胞的核不同的正常细胞数。丫啶橙插入DNA使之呈现绿色荧光，丫啶橙亦能结合至RNA，但不能插入，使RNA呈现红橙色荧光。如此细胞核呈绿色荧光而胞浆呈红橙色荧光。非凋亡细胞（活细胞或死亡细胞）胞核均可染成具有一定结构的绿色荧光，且常染色质与异染色质的荧光密度不同；而凋亡的细胞核则呈均匀密度的荧光，染色质高度浓缩，核外周形成“新月状”，系核本身的荧光染色呈现的明亮球状小体。当细胞的程序性死亡进一步发展后，细胞失去DNA，或DNA断裂包入“凋亡小体”，此时与正常细胞相比失去明亮度。凋亡细胞的百分率按下式计算：

凋亡细胞（％） =具有凋亡核的细胞数/计数的细胞总数× 100

若用丫啶橙和溴化乙锭混合液染色，计数200个细胞总数，并分别计数下列4种细胞状态的各自数目：

①具有正常核的细胞（VN，明亮的绿色染色质，且具正常的结构）；

②含有凋亡核的活细胞（VA，明亮的绿色荧光，且呈高度聚集或断裂）；

③具有正常核的死细胞（NVN，明亮的染色质，具有正常结构）；

④具有凋亡核的死细胞（NVA，明亮的染色质，高度聚集或断裂）。

与单独丫啶橙染色一样，活细胞和死细胞的核均染成绿色（DNA着色），而RNA呈红色。因此活细胞被染成绿色的核和红色的胞浆，而死细胞则无红色胞浆。溴化乙啶仅着染死细胞，可使DNA染成桔红色，而仅很弱地结合RNA使之呈红色。两种染料混合着染后，死细胞将呈现明亮的桔红色染色质（溴化乙啶覆盖丫啶橙所致），且胞浆若有内容物残留可呈暗红色。应用此法，活细胞内正常的或凋亡的核都可呈现绿色，而死细胞中正常或凋亡的核均为鲜桔红色。按下式计算凋亡指数和坏死细胞百分率：

凋亡细胞百分率（凋亡指数） =( VA+NVA )/(VN+VA+NVN+NVA)× 100

坏死细胞百分率 = NVN /(VN+VA+NVN+NVA)× 100

死细胞百分率 = (NVN+NVA)/(VN+VA+NVN+NVA) × 100

假如细胞已经死亡一定时间，或DNA已经进入凋亡小体，此时细胞可以失去染色质而导致不能精确地检测细胞活性。