蛋白质粉的定量测定实验步骤

蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一目前常用的有两种古老的经典方法，即酚试剂法和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法。其中酚试剂法和考马斯亮蓝法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍。。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。

可以选择高蛋白的食物浆液，比如豆浆和蛋清。然后准备检测蛋白质的双缩脲试剂，由A液和B液组成，A液：氢氧化钠的质量分数为0.1 g/mL的水溶液。B液：硫酸铜的质量分数为0.01 g/mL的水溶液。

在实验时，需要现在待测液体中先在加入A液，先制造出碱性环境，满足B液与蛋白质反应的条件，这样才可以方便进行蛋白质的检测。一段时间后，如果试管中的液体变为紫色，说明待测液体中含有蛋白质，而且颜色深浅与蛋白质浓度成正比。

(1) 准备 100~1500 ug/ml 的标准品, 溶于 Bradford 法相兼容缓冲液中。对于较稀的样品，可能通过增加样品在试剂体积中的比率而扩大灵敏度（microBradfordassay:1~25ug/mL)。如果样品与染料的比值太高, 可能会增加反应混合物的 PH 而导致反应背景较高。

(2) 将标准品和待测样品加人到一次性的比色皿中 (应该使用一次性的塑料比色皿或微孔板，因为染料会黏附到各种材料容器的表面上）。

(3)Bradford 试剂预热至室温。将 ImL 染料溶液加人到 25 uL 蛋白质样品中，混勻，室温孵育 10 min。

(4) 检测 450rnn 和 595nm 处的吸光度 (可以使用 570~610nm 的基于滤光器的仪器，对检测性能不会有明显的降低）。