Western实验步骤

一、样品制备

对于Western Blotting实验而言，样品处理是关键步骤之一，获得的蛋白样品必须均质、可溶，并解离成单个多肽亚基，且尽量减少相互间的聚集，使其最终仅依赖本身的分子量大小进行分离。当目标蛋白的含量很低时，需要选取目标蛋白含量较高的组织或细胞器（如核抽提物），或者通过免疫沉淀等方式进行富集。通常样品有重组蛋白、细胞和组织等。

1. 样品收集

1）培养的细胞

贴壁和悬浮细胞收集方式不同，细胞裂解液种类各异，推荐含SDS的凝胶加样缓冲液裂解，煮沸即可。

2）动物组织

与细胞不同，组织块由于体积较大，须预先经破碎匀浆处理。

2. 样品定量

样品电泳前需测定蛋白浓度，以便保证上样量一致，有利于后续定量或半定量分析。常用的蛋白质浓度测定方法有好多种，其灵敏度和所需时间不同，且不同的方法会受不同干扰物质的影响，实验者可根据样品制备方法（裂解液成分、去垢剂和还原剂种类等）自行选择。

几种蛋白质浓度测定方法比较

注意事项：

a. 应尽量避免引入影响后续定量的杂蛋白（如细胞培养液、蛋白酶抑制剂等）及其他干扰物质；

b. 样品浓度应适中，1×SDS凝胶加样缓冲液建议用量：贴壁细胞按10cm2培养皿/0.1ml,悬浮细胞按5×106细胞/0.1ml比例加入；

c. SDS对蛋白质变性和电泳分离至关重要，浓度应控制在2-10%之间，并根据具体需要调整；

d. 制备好的样品可以在-20℃保存，但时间不宜过长，并避免反复冻融，否则蛋白会发生降解；

e. 内参对实验结果至关重要，应选择合适的内参。

二、电泳

电泳分为非变形凝胶电泳和变性凝胶电泳，Western Blotting中常用的是不连续缓冲系统下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），该法中由于变性的多肽与SDS结合而带负电荷，在凝胶电泳中迁移率仅与多肽的分子量相关。凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。

SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围