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各类western转膜条件

最新修订时间:

材料与仪器

除了抗体原因,转膜恐怕是western blot成败的最关键因素。

园子里好多好多人在求助转膜时间,因此我们总结了一系列分子量蛋白转膜的时间,希望对大家有用。

蛋白来源:RAW264.7 总蛋白
蛋白名称(可保密):一些转录因子
蛋白分子量:40~70 KD
WB用膜类型、孔径:0.45 NC
转膜方式(恒压、恒流):湿转 恒流400 mA
转膜时间:60~90 min
PS.其实吧,以我的经验来看,除非目的蛋白特别小,或者特别大,不然转膜时间真的不是那么重要,曾经因为失误,转了15 min就拆下来了,但从丽春红染色来看,跟平常实验也没有太大的区别。

蛋白来源:内皮细胞 总蛋白
蛋白名称(可保密):occludin & AKT
蛋白分子量:65 KD & 56 KD
WB用膜类型、孔径:0.45 PVDF
转膜方式(恒压、恒流):湿转 恒压 100 V
转膜时间:60~70 min
设备名字是“Bio-Rad mini”。

蛋白来源:乳鼠心肌细胞和成年鼠心肌组织 总蛋白和核蛋白
蛋白名称(可保密):保密
蛋白分子量:65 KD & 55 KD
WB用膜类型、孔径:PVDF(预先用甲醇处理)
转膜方式(恒压、恒流):半干转 恒压 12 V
转膜时间:30-40 min
设备:“Bio-Rad mini”
建议:最开始做过湿转(过夜的那种),太费事费时,效果也不如半干转。

蛋白来源:293T细胞
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:95 KD & 35 KD
WB用膜类型、孔径:PVDF
转膜方式(恒压、恒流):湿转 恒压 90 V-110 V,控制电流不要超过300 mA。
转膜时间:70 min

蛋白来源:肿瘤手术标本
蛋白名称(可保密):转录因子
蛋白分子量:33 KDa
WB用膜类型、孔径:PVDF膜
转膜方式(恒压、恒流):350 mA 恒流
转膜时间:150 min
转膜设备:湿转 Bio-Rad
说明:相同条件曾用于数个30-70 KDa的蛋白,都能成功转上,不过没有试缩短时间效果如何;实验时没为转膜条件苦恼,倒是电泳时胶的浓度及时间根据不同分子量而有区别。

蛋白来源:成纤维细胞
蛋白名称(可保密):smad3
蛋白分子量:54 KDa
WB用膜类型、孔径:PVDF膜
转膜方式(恒压、恒流):350 mA 恒流
转膜时间:150 min
转膜设备:湿转 Bio-Rad


步骤

蛋白来源:胰腺癌细胞
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:16 KDa and 42 KDa
WB用膜类型、孔径:PVDF膜
转膜方式(恒压、恒流):120 V 恒压
转膜时间:90 min
转膜设备:湿转 Bio-Rad

蛋白来源:大鼠血管平滑肌细胞
蛋白名称(可保密):保密
蛋白分子量:72 KD,42 KD 和22 KD
WB用膜类型、孔径:一般的PVDF膜
转膜方式(恒压、恒流):湿转,恒流一张膜0.26 A,两张膜0.3 A。
转膜时间:90 min
设备:“Bio-Rad mini”
建议:转膜缓冲液最多用3次,最好现用现配,我们用的没有加SDS,转的时候最好能用冰块一类的东西降一下温,这样转的效果要好一些,转的时候一定要把三明治每层之间的气泡除去,同时使滤纸大于膜,膜大于胶,以免烧坏电极。

蛋白来源:大鼠PBMC
蛋白名称(可保密):保密
蛋白分子量:55 KD
WB用膜类型、孔径:0.22的PVDF膜
转膜方式(恒流):湿转
转膜时间:60-90 min
设备:“Bio-Rad mini”
建议:转膜液用过两三次之后转膜效果就很差了 其它按照常规就好了 其实0.22的膜一般不怕转过头 以我们的经验,转膜时间、电压其实也有很大范围的调整 ,并不是非要固定于哪一个最合适,曾经做过 一张膜转,17 KD的和170 KD的,按照170 KD的条件,17 KD的转膜也很好的。

蛋白来源:人非小细胞肺癌细胞系
蛋白名称(可保密):保密
蛋白分子量:大于250 kD
WB用膜类型、孔径:millipore PVDF膜 0.45 um
转膜方式(恒压、恒流):湿转,恒流0.3A。
转膜时间:180min
设备:“Bio-Rad ”
建议:电转保持电压在70 V以上,保持低温,如果电压低过70就需要换缓冲液了。

蛋白来源:白血病细胞
蛋白名称(可保密):保密
蛋白分子量:28 KD
WB用膜类型、孔径:0.45的NC膜
转膜方式(恒流):湿转,90 min,0.25 A
设备:“Bio-Rad ”
建议:海绵厚度要合适,一次转磨用的海绵太薄,导致三明治没夹紧,转膜后拿出来一看,marker都变得七扭八歪。但是有前辈说垫的海绵太厚可能将胶压断,没经历过,不知道是不是会有这种情况。

蛋白来源:肿瘤细胞
蛋白名称(可保密):磷酸化蛋白
蛋白分子量:10-200 KDa
WB用膜类型、孔径:millipore PVDF膜 0.45 um
转膜方式(恒压、恒流):120 v 恒压
转膜时间:120 min
转膜设备:湿转 Bio-Rad
建议:转膜缓冲液只用2次,基本都转上,5%BSA封闭,减少背景。
蛋白来源:胰腺β细胞
蛋白名称(可保密):*****~K~Hdiv~M~Kdiv~M蛋白分子量:90-130 KDa
WB用膜类型、孔径:PVDF膜
转膜方式(恒压、恒流):250 mA 恒流
转膜时间:150 min
转膜设备:湿转
蛋白来源:原核表达
蛋白名称(可保密):保密
蛋白分子量:38 KD
WB用膜类型、孔径:0.45 NC
转膜方式(恒压、恒流):湿转 恒压:100 V
转膜时间:120 min
蛋白来源:心脏
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:220 kDa,130 kDa,70 kDa,41kDa
WB用膜类型、孔径:PVDF
转膜方式(恒压、恒流):恒压
转膜时间:70 v120 min,180 min,5-6 h
转膜设备:伯乐湿转
建议改进方向(可选):40 kDa一下,70 v ,60-90 min足够,40-70 kDa 90-120 min即可。
70-120 kDa ,70 v,120-180 min足够,120-180 kDa ,180-240 min,180 kDa以上建议6 h。
蛋白来源:卵巢癌细胞膜蛋白
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:53 KD
WB用膜类型、孔径:PVDF膜 0.45 um
转膜方式(恒压、恒流):恒压
转膜时间:80 V 100 min
转膜设备:湿转 Bio-Rad
蛋白来源:人宫颈癌HELA细胞总蛋白
蛋白名称(可保密):β-actin
蛋白分子量:42
WB用膜类型、孔径:PVDF膜 0.45 um
转膜方式(恒压、恒流):恒压
转膜时间:50 4 h
转膜设备:湿转 Bio-Rad
蛋白来源:脑组织
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:16 KD、27 KD、32 KD、42 KD
WB用膜类型、孔径:PVDF 0.22 um
转膜方式(恒压、恒流):半干转 恒流 1 mA/cm2或2 mA/cm2
转膜时间:不定
转膜设备:北京六一仪器
建议:我共做了六个蛋白,所以总在想节约时间的方式。
在预试时我会观察电压数与转膜效率的关系,所以我不会按时间来定何时转完,而是按电压来定。通过染胶来确定电压数与转移蛋白分子量上限的关系。这样有的5分钟就转完了,不用多浪费时间。并且六一的半干转膜仪随着使用次数的增多,效率也会下降,所以时间和转膜效率(尤其是使用后期)的关系并不稳定,单纯依靠时间有时会有问题。
蛋白来源:CHO cell
蛋白名称(可保密):酶原
蛋白分子量:40 KD
WB用膜类型、孔径:0.22的PVDF膜(Biorad)
转膜方式(恒压):100 V,湿转,转膜时间:60 min。
设备:Tanon(上海天能)
建议:
1. 转膜液现用现配,用完倒掉。
2. 转膜时间,电压可以适当调整。分子量大或者小一些的蛋白,采用此条件一样转膜效率很高。
蛋白来源:Hepg2
蛋白名称(可保密):EGFR
蛋白分子量:170kd
WB用膜类型、孔径:pvdf 0.45
转膜方式(恒压、恒流):24V
转膜时间:2个半小时
转膜设备:伯乐半干转
蛋白来源:肝癌细胞
蛋白名称:HIF-1α
蛋白分子量:120 kD
WB用膜类型、孔径:NC膜
转膜方式(恒压):80伏,湿转
转膜时间:150分钟
设备:“Bio-Rad mini”
建议:湿转,转膜液特别重要,否则会导致电压或者电流不稳影响转膜条带。转膜均现配先用,不重复利用。转膜时间一般是150分钟,80伏恒压。经李春红染色,靠近蛋白胶的一侧膜上蛋白染色深,膜另外一面染色浅,说明蛋白未转过。该湿转条件自己做过的蛋白分子量范围:170-36 kD。
蛋白来源:心肌细胞总和膜
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:128 KD,100,60,55,43 KD
WB用膜类型、孔径:NC膜 0.2 um
转膜方式(恒压、恒流):恒压
转膜时间:70 V 200 min
转膜设备:湿转 Bio-Rad
建议:转膜液最好现配现现用,或配成母液,最好不重复使用,70 V电压下,电流约154 mA。甲醇可以加到150 ml。对大分子量如200 KD转膜时间延长6-8 h。


来源:丁香实验

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